اولین گزارش از Diplodia malorum Fuckel عامل بیماری شانکر درختان سیب در ایران*

در تابستان سال 1388 بیماری خشکیدگی شاخه و شانکر تنه درختان سیب (malus domestica borkh.) رقم گلدن در باغات استان آذربایجان غربی دیده شد. بیماری در اثر تنش های محیطی مثل خشک سالی و سرمازدگی گسترش یافته، پوست و سیستم آوندی درخت در محل آلودگی کاملا تیره می شود و محل شانکر در تنه اصلی و شاخه‌ها پوسته پوسته می گردد. جهت جداسازی، بافت های آلوده و مشکوک به بیماری به مدت 3 دقیقه در اتانول 70 درصد ضد عفونی سطحی گردیده و 3 مرتبه با آب مقطر سترون شسته شدند. قطعات پس از خشک شدن بین کاغذ صافی سترون، روی محیط کشت pda منتقل و در دمای 25 درجه سلسیوس و تاریکی قرار داده شدند. از قارچ‌های رشد کرده در حاشیه بافت‌های گیاهی، قطعاتی برداشته شده و به محیط کشت آب آگار 2 درصد منتقل و عمل خالص سازی به روش کشت نوک ریسه انجام گرفت. برای القای تشکیل اندام‌های باردهی غیر جنسی، از روش سوزن کاج قرار گرفته روی محیط کشت آب آگار 2 درصد استفاده گردید. تشتک‌های مایه‌زنی شده به مدت 4 هفته در دمای 25 درجه سلسیوس و در زیر نور نزدیک ماورا بنفش (near-uv) و با دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی جهت تولید پیکنیدیوم‌ها نگهداری شدند (pavlic et al. 2008). برای شناسایی قارچ‌های رشد یافته، معیارهای مختلف ماکروسکوپی از قبیل رنگ و خصوصیات ظاهری رشدی پرگنه و مشخصات میکروسکوپی از قبیل رنگ، شکل و ابعاد کنیدیوم، سلول‌های کنیدی‌زا و پیکنیدیوم مورد مطالعه قرار گرفتند. برای تایید شناسایی مورفولوژیک، بخش its در یکی از جدایه های منتخب، با استفاده از آغازگر های its1 و nl-4 تکثیر و ترادف یابی گردید. بر اساس مطالعات مورفولوژیک و ترادف یابی بخش its ، گونه diplodia malorum شناسایی شد. مشخصات توصیفی گونه به شرح زیر است: بافت پرگنه در ابتدا سفید رنگ، ولی بعد از گذشت دو هفته به رنگ زیتونی نخودی تا زیتونی متمایل به سبز تغییر یافته و در نهایت بعد از سه هفته کاملاً سیاه می شود. کنیدیوماتاها به صورت پیکنیدیومی، به قطر تقریبی 600 × 500 میکرومتر، به طور منفرد یا در دسته‌های چندتایی به شکل گرد تا تقریباً مخروطی، به رنگ قهوه‌ای تیره تا سیاه و فرورفته در بافت و در هنگام بلوغ کمی شکوفا می‌باشند. سلول‌های کنیدی‌زا بی‌رنگ، صاف، استوانه‌ای شکل، در قسمت پایه متورم و به ابعاد 16- 7 × 5- 5/2 میکرومتر هستند. کنیدی‌زایی در یک سطح با قطور شدگی حاشیه‌ای (priclinal) و یا به صورت percurrent و دارای 2 یا 3 حلقه می‌باشد. کنیدی‌ها با دیواره ضخیم، با سطح بیرونی صاف و سطح درونی زگیل‌دار، تقریباً بیضی کشیده تا استوانه ای، در هر دو انتها گرد، ابتدا بی رنگ و یک سلولی بوده و به مدت طولانی در داخل پیکنیدیوم بی‌رنگ باقی می مانند ولی بعد از خروج از پیکنیدیوم، به رنگ قهوه‌ای تیره تغییر می یابند و دارای یک دیواره عرضی (ندرتا 2 دیواره عرضی) و به ابعاد16-11 × 34-5/19 میکرومتر می‌باشند (شکل 1). جستجوی بلاست توالی به‌دست آمده با توالی های موجود در بانک ژن شباهت 100 درصدی آن را با جدایه های گونه diplodia malorum تایید نمود (phillips et al. 2012). آزمون اثبات بیماری زایی، با تلقیح جدایه‌ها روی نهال‌های دو ساله و هم چنین میوه سیب رقم گلدن در قالب طرح کاملاً تصادفی به همراه تیمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت 8 هفته، تمام نهال های تلقیح شده توسط جدایه های قارچی علایم شانکر، سیاه و خشک شدن پوست در اطراف محل تلقیح شده را نشان دادند، در صورتی که در تیمار شاهد، هیچ‌گونه سیاه شدگی و یا خشک شدن پوست مشاهده نگردید و بافت کالوز در اطراف زخم ناشی از برداشتن حلقه تشکیل و رشد عادی نهال‌ها ادامه یافت. در مورد میوه ها، مطالعات بیماری زایی نشان داد که بعد از گذشت 6 روز، در اطراف محل تلقیح، علایم پوسیدگی قهوه ای تیره با حاشیه کاملاً مشخص و متمایز از بافت سالم ایجاد شد و در برش عمودی از محل تلقیح، پیشرفت پوسیدگی به داخل میوه به طور مشخصی مشاهده گردید، در صورتی‌که در تیمار شاهد هیچ گونه علایم پوسیدگی یا تغییر رنگ ایجاد نگردید (شکل 2). از بافت‌های تازه آلوده شده و دارای نشانه‌های سیاه شدگی پوست در نهال ها و میوه ها، بعد از عمل ضد عفونی سطحی، عمل جداسازی و شناسایی قارچ مجددا انجام گرفت و به این ترتیب اصول کخ اثبات شد. نتایج تجزیه واریانس آزمون اثبات بیماری‌زایی نشان داد که تمام جدایه‌های مورد مطالعه، روی نهال ها و میوه های سیب بیماری زا بوده و نسبت به تیمار شاهد تفاوت معنی‌داری نشان دادند. بر اساس بررسی منابع، این اولین گزارش از وجود و تعیین بیماری زایی گونه diplodia malorum مرتبط با شانکر درختان سیب در ایران می باشد.