تنوع فنوتیپی و ژنوتیپی گونه‌‌های باسیلوس درون‌‏رُست در ریشه درختان ممرز (.carpinus betulus l) در استان‌‌های مازندران و گلستان

سابقه و هدف: باکتری‌‌های درون‌‏رُست به‌ویژه گونه‌‌های باسیلوس (bacillus spp.)، به‌دلیل ویژگی‌های سودمند و ایمنی محیط‌زیستی به‌عنوان منبعی مهم برای افزایش رشد و مقاومت گیاهان در برابر تنش‌‌های زنده و غیرزنده استفاده می‌شوند. باتوجه‌به اینکه حفاظت از تنوع گیاهی و پایداری موجود در جنگل‌های هیرکانی، اهمیت ویژه‌‌ای در مدیریت این بوم‌‌سازگان حیاتی شمال کشور دارد، شناسایی و تعیین ویژگی‌‌های باکتری‌‌های مفید و ارزشمند با اثرات محافظت‌‌کنندگی در گیاهان این منطقه می‌‌تواند نقش مهمی در این زمینه داشته باشد. پژوهش پیش‌رو با هدف جداسازی، شناسایی و ارزیابی تنوع جدایه‌‌های ‌‌باسیلوس درون‏‌رست در ریشه درختان ممرز (carpinus betulus l.) در جنگل‌‌های هیرکانی انجام شد.مواد و روش‌‌ها: جدایه‌‌های باسیلوس با روش نمونه‌‌برداری تصادفی از ریشه درختان ممرز در جنگل‌‌های استان‌های مازندران و گلستان جداسازی شدند. سوسپانسیون حاصل از ریشه‌‌های ضدعفونی سطحی و سپس خردشده در آب مقطر در محیط tryptic soy agar کشت شد. تک‌‌کلونی‌‌ها براساس ویژگی‌های ریخت‌شناختی انتخاب و با واکشت خالص شدند. تعلق جدایه‌های به‌دست‌آمده برپایه ریخت‌‌شناسی کلونی، تولید اندوسپور، واکنش گرم و فعالیت اکسیداز و کاتالاز به جنس باسیلوس مشخص شد. ویژگی‌های فنوتیپی و نیز مولکولی جدایه‌‌ها با به‌‌کارگیری pcr با آغازگرهای is50، box و rep تعیین شد. داده‌‌ها در صورت حضور با عدد یک و عدم حضور با عدد صفر با استفاده از نرم‌‌افزار totallab tl120 کدگذاری و ماتریس تشابه و درخت فیلوژنتیکی به‌ترتیب با استفاده از نرم‌‌افزار ntsys 2.02e و الگوریتم upgma ترسیم شدند. یک نماینده از جدایه‌‌های هر گروه انتخاب شد. سپس، آن‌ها برای شناسایی مولکولی با به‌کارگیری آغازگرهای ناحیه s rdna16 و ژن hsp60 با pcr تکثیر شدند. قطعه تکثیرشده پس از خالص‌‌سازی برای تعیین ترادف به شرکت microsynth سوئیس ارسال شد. ترادف‌‌های به‌دست‌آمده با ترادف‌‌های موجود در ژن‌‌بانک ncbi به روش blastn مقایسه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از مقایسه ترادف‌های نوکلئوتیدی جدایه‌ها با گونه‌‌های باسیلوس موجود در ‌بانک ژن با استفاده از نرم‌‌افزار mega x و به‌‌کارگیری الگوریتم‌‌های درست‌نمایی بیشینه و اتصال همسایه با درجه اعتبار‌سنجی 1000 رسم شد. فعالیت ضدباکتریایی جدایه‌‌های باسیلوس با کاربرد عصاره دی‌‌کلرومتان و روش دیسک کاغذی برعلیه باکتری brenneria roseae، عامل بیماری خیسی چوب درختان ممرز بررسی شد. توانایی جدایه‌‌ها در تولید زی لایه (بیوفیلم)، پروتئاز، سیانید هیدروژن و هورمون ایندول استیک اسید (iaa) نیز ارزیابی شد.نتایج: درمجموع، 30 جدایه باکتری از نمونه‌‌های تهیه‌شده از ریشه‌‌ درختان ممرز جداسازی شد. هیچ کلونی‌‌ باکتری در تشتک‌‌های شاهد مشاهده نشد که می‌‌تواند نمایانگر کارایی مطلوب روش ضدعفونی‌‌سازی سطحی به‌کاربرده‌شده و شاهدی بر درون‏رست بودن جدایه‌‌های به‌دست‌آمده محسوب شود. جدایه‌‌ها براساس ویژگی‌‌های فنوتیپی و ژنوتیپی در سه گروه مجزا قرار گرفتند. مقایسه ترادف ناحیه تکثیرشده از s rdna16 و hsp60 با ترادف‌‌های موجود در ژن‌‌بانک ncbi و درخت فیلوژنتیکی ترسیمی نشان‌‌دهنده وجود گونه‌‌های bacillus thuringiensis، b. subtilis و b. mycoides در نمونه‌‌ها بود. گونه b. thuringiensis بیشترین فراوانی و b. subtilis در رتبه بعدی و b. mycoides واجد کمترین فراوانی بودند. ترادف‌‌های حاصل از hsp60، تعیین دقیق موقعیت تاکسونومیکی جدایه‌‌های باسیلوس در سطح گونه را امکان‌‌پذیر کرد. سطح iaa تولیدی جدایه‌‌ها از هشت تا 75 میلی‌گرم در لیتر متغیر بود. جدایه‌‌های b. mycoides بیشترین و جدایه‌‌های b. subtilis کمترین سطح تولید را داشتند. اغلب جدایه‌‌ها قادر به تولید آنزیم‌‌های لیپاز، ژلاتیناز، لسیتیناز، پروتئاز و آمیلاز بودند. جدایه‌‌های b. thuringiensis بیشینه سطح پروتئاز را تولید کردند و بیشینه مقدار زی لایه توسط جدایه‌‌های b. subtilis تولید شد. بیشترین هاله بازدارنده عصاره‌‌ی دی‌‌کلرومتان جدایه‌‌های باسیلوس برعلیه b. roseae متعلق به جدایه raqa2 گونه b. subtilis (با قطر بازداری 3.25±18.0 میلی‌‌متر) بود.نتیجه‌‌گیری کلی: علاوه‌بر تنوع حاصل از گروه‌‌بندی فنوتیپی و مولکولی، وجود تنوع در برخی از ویژگی‌‌های فیزیولوژیکی در جدایه‌‌های باسیلوس می‌‌تواند نشانگر تاثیر بالقوه بعضی از جدایه‌‌ها در تولید هورمون‌‌های محرک رشد و افزایش ایمنی گیاهان باشد. همچنین، اثرات ضدباکتریایی و حفاظتی آن‌ها می‌تواند به‌عنوان عوامل زیست‌کنترل در گیاهان جنگلی در برابر عوامل بیماری‌زای باکتریایی محسوب شود. این پژوهش، اولین بررسی در زمینه شناسایی مولکولی و تعیین ویژگی‌‌های جدایه‌‌های باسیلوس درون‌‏رست ریشه ممرز در ایران است.

assessment of the phenotypic and genotypic diversity of endophytic bacillus strains isolated from the roots of hornbeam (carpinus betulus l.) in mazandaran and golestan provinces, iran

background and objectives: the beneficial characteristics of endophytic bacteria in general and environmental safety features of bacillus spp. in particular, have made them potentially efficacious bacteria for plant growth promotion as well as plant defense elicitation against biotic and abiotic stresses. given that the preservation of biodiversity and sustainability of the hyrcanian forests in iran is of utmost importance ecologically and environmentally, proper management of this ecosystem demands considerable attention and care. studying the microbiome structure and activities, including determination of microorganisms living as endophytes or commensals can be regarded as the starting steps in this context. this study was aimed at the molecular identification and physiological characterization of endophytic bacillus isolates recovered from the roots of hornbeam (carpinus betulus l.) trees in some different locations of hyrcanian forests.methodology: samples of hornbeam roots were randomly collected from mazandaran and golestan provinces, iran, in the early spring of 2020. root segments were surface-disinfected, washed in sterile distilled water (sdw) and crushed in drops of sdw using a sterile mortar and pestle. isolation of bacteria was done by spreading drops of the suspension on plates of tryptic soy agar (tsa). single colonies were selected after 3-4 days of incubation at 28˚c and restreaked on tsa to obtain pure cultures. initial identification of the isolates was based on colony morphology, gram-stain reaction, position of endospores, and production of catalase and oxidase. the isolates were characterized phenotypically and their diversity was assessed by comparing their dna fragment patterns following their amplification by rep-, box- and is50-pcr and electrophoresis on agarose gels. the data were converted into a binary matrix using totallab tl120 software, where the digits 1/0 represented the presence/absence of a dna band. the similarity matrix and clustering were generated by the use of ntsys 2.02e software based on the unweighted pair group method with arithmetic average (upgma) clustering algorithm. a representative isolate was selected for each of the dna profile groups and a fragment of the 16s rrna and hsp60 genes of each was amplified by pcr. pcr products were sequenced by microsynth company (switzerland) through the sanger sequencing method. the nucleotide sequences were aligned and compared with those of a collection of bacillus species retreived from genbank using the blastn program. phylogenetic trees were constructed using the maximum-likelihood and neighbor-joining methods with 1000 bootstraps in mega x software package. antibacterial activity of bacillus isolates against brenneria roseae, the causal agent of hornbeam wetwood disease, was investigated using sterilized blank paper disk impregnated with extracts prepared in dichloromethane. the isolates were assessed for their capacity to produce indole acetic acid (iaa), hydrogen cyanide, protease, and biofilm.results: thirty bacterial strains were isolated from hornbeam roots on tsa medium and subsequently characterized. the absence of bacterial colonies on the tsa plates inoculated with the final rinse water from the uncrushed bark fragments indicated the effectiveness of the surface disinfection procedure.