بارکدگذاری dna و مطالعه بیوسیستماتیک گیاه دارویی پنج‌انگشت (vitex agnus-castus l.) در استان گلستان

سابقه و هدف: گیاه پنج‌انگشت (vitex agnus-castus) یک گیاه دارویی محبوب متعلق به تیره lamiaceae، بومی مدیترانه و پراکنده در اروپا، آسیا و شمال آفریقاست. این گیاه جزو پرفروش‌ترین گیاهان دارویی در جهان است؛ با وجود تحقیقات زیاد، همواره بررسی این گونه باارزش حائز اهمیت است. چندین گونه که در‌ حال حاضر در سرده vitex شناخته شده‌اند، مورفولوژی قابل تشخیصی از خود نشان نمی‌دهند که منجر به سردرگمی در شناسایی آنها می‌شود. از‌ آنجا که کاربرد داروییv. agnus-castus  با سایر گونه‌ها متفاوت است، بنابراین، شناسایی مناسب این گونه‌ برای عملکرد دارویی موثر ضروریست. در این مطالعه از رویکردهای کلی در شناسایی این گیاه دارویی ازجمله تکنیک‌های مورفولوژیکی و میکرومورفولوژی و مولکولی استفاده شد.مواد و روش‌ها: در این مطالعه، 17 جمعیت از گونه مورد نظر در شهرستان مراوه‌تپه واقع در ناحیه شرقی استان گلستان بررسی شد. نمونه‌های گرده به‌طور مستقیم از رویشگاه طبیعی منطقه مورد ‌نظر جمع‌آوری گردید. پس از استفاده از روش استولیز، از 30-40 دانه‌گرده از نماهای قطبی و استوایی با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 و 100 و با کمک دوربین دیجیتال عکس‌برداری انجام شد. برای مطالعه ریخت‌شناسی دانه، میوه‌های کاملاً رسیده از هریک از جمعیت‌های مورد مطالعه در فصل میوه‌دهی جمع‌آوری شد. از هر جمعیت 20 دانه برای عکس‌برداری با لوپ و میکروسکوپ الکترونی نگه‌داری شد. میکروگراف‌های الکترونی از دانه‌ها و گرده‌های مناسب در مرکز متالورژی رازی تهران توسط میکروسکوپ الکترونی sem تهیه شد. استخراج‌ dna از سلول‌های برگ نمونه‌های هرباریومی با استفاده از کیت گیاهی انجام گردید. از توالی ناحیه nrdna its ژنوم هسته‌ای و‌trnl-trnf  کلروپلاستی به‌عنوان بارکد استفاده گردید. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 20 میکرولیتر با آغازگرهای مورد نظر و برنامه دمایی مشخص در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. پس از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، به منظور حصول اطمینان از تکثیر قطعات، محصول نهایی الکتروفورز شد. تک باندهای قوی برای تعیین توالی به شرکت ژنتیک کدون در تهران ارسال گردید. توالی‌های کروماتیدی حاصل، با اطلاعات موجود در بانک ژنی سایت ncbi تطبیق داده شدند و میزان شباهت گونه‌ها بررسی شد.نتایج: دانه‌های گرده تمام گونه‌ها از لحاظ اندازه کوچک (28-12 میکرومتر) می‌باشند. شکل دانه گرده طبق طبقه‌بندی ارتمن در جمعیت‌های قازان‌قایه به شکل prolate spheroidal  (کروی کشیده) و در جمعیت‌های قوشه‌تپه از نوع‌subprolate  (نیمه‌کشیده) هستند. تمام دانه‌های گرده دارای سه شیار می‌باشند. تزئینات اگزین از نوع ریزمنفذدار در جمعیت قازان‌قایه و شبکه‌ای ریزمنفذدار در جمعیت قوشه‌تپه هستند. بزرگترین دانه‌ها مربوط به جمعیت قازان‌قایه با میانگین طول 3.84 میلی‌متر و عرض 1.52 میلی‌متر می‌باشد. از نظر شکل همه بادامی‌شکل هستند اما تزئینات سطح خارجی دانه در جمعیت قازان‌قایه حفره‌دار است؛ ولی در جمعیت‌های قوشه‌تپه سطح دانه چروکیده و مخطط است. میزان موفقیت تکثیر در مکان ژنی trnl-trnf در نمونه‌های گیاهی مورد بررسی 85% محاسبه شد. طول قطعه تکثیر‌شده در این گونه 516 نوکلئوتید بود. توالی آن به بانک ژن به‌منظور ثبت نهایی ارسال شد. طول قطعه تکثیر شده در این گونه با استفاده از نشانگر its 675 نوکلئوتید توالی‌یابی شد و کروماتوگرام‌های حاصل، با اطلاعات موجود در بانک اطلاعاتی (ncbi) تطبیق داده شدند.نتیجه‌گیری: امروزه داروهای گیاهی محلی در کشورهای مختلف نقش سازنده‌ای در درمان بیماری‌ها دارند. ازاین‌رو بازاریابی حقیقی و مصرف گیاهان دارویی توجه بیشتری می‌طلبد. بارکدینگ این هدف را به درستی محقق می‌کند. به‌طوری‌که بارکدگذاری dna گونه‌های دارویی که صحیح شناسایی شده‌اند، می‌توانند به‌عنوان یک استاندارد برای مقایسه نمونه‌های گیاهی موجود در بازار با گیاهان دارویی حقیقی استفاده شوند. بنابراین توالی‌های به‌کاررفته این تحقیق برای بارکدگذاری گیاه دارویی پنج‌انگشت مهم است. این گونه‌‌ دارویی به‌درستی شناسایی شده‌ است و می‌تواند به‌عنوان استاندارد برای ارزیابی گیاهان موجود در بازار استفاده شود.

dna barcoding and biosystematics study of vitex agnus-castus l. in golestan province

background and objectives: as a member of the lamiaceae family native to europe, asia, and north africa, vitex agnus-castus is a popular medicinal plant. despite much research, it is always essential to verify the safety of this valuable species, as it is among the world’s best-selling plants. several species in the genus vitex do not exhibit recognizable morphologies, confusing their identification. the medicinal use of v. agnus-castus differs from that of other species. for effective pharmaceutical performance, the identification of this species is essential. this study used morphological, micromorphological, and molecular approaches to identify this medicinal plant.methodology: a total of 17 populations of the target species were investigated in maraveh tappeh, a city in the golestan province located in the eastern region. pollen samples were collected directly from the natural habitat of the target area. after acetolysis, 30-40 pollen grains were photographed from the polar and equatorial views with a light microscope and 40 and 100 magnification and with the help of a canon digital camera. in order to study the seed morphology, fully ripe fruits were collected from each studied population during the fruiting season. twenty seeds from each population were kept for photography with light microscopy and scanning electron microscopy (sem). electron micrographs were prepared from suitable seeds and pollen at the razi metallurgical research center (rmrc) using an sem electron microscope. leaf cells from herbarium samples were extracted from dna using a dna extraction kit. plastid trnl-trnf sequences and nrdna its region sequences were used as barcodes. polymerase chain reaction (pcr) was performed in 20 microliters with desired primers and a specific temperature program in a thermocycler. after performing the polymerase chain reaction, in order to ensure the amplification of fragments, the final product was electrophoresed. strong single bands were sent to codon genetics company in tehran for sequencing.results: pollen grains of all species are small (12-28 micrometers). according to ertman’s classification, ghazan ghayeh pollen grains are prolate spheroidal (elongated spherical), and ghoshe tappeh pollen grains are subprolate (semi-elongated). all pollen grains are tricolporate. ghazan ghayeh ornamentation is micro-perforated, while ghoshe tappeh ornamentations are reticulated-micro-perforated. with an average length of 3.84 mm and width of 1.52 mm, ghazan ghayeh seeds are the largest. they are all almond-shaped, but in the ghazan ghayeh population, the outer surface of the seed is hollow; in the ghoshe tappeh population, the surface is wrinkled and striated. the trnl-trnf gene locus was found to have a multiplication success rate of 85% in the examined plants. there were 516 nucleotides in the amplified fragment in this species. for final registration, the sequence was sent to the genbank. a 675 nucleotide fragment amplified from this species’ its marker was sequenced, and the chromatograms were compared with the ncbi database. the gene bank has been notified of the sequence determination. the results showed the highest similarity (98%) with the vitex agnus-castus species reported from america.conclusion: local herbal medicines are gaining popularity in different countries and play a significant role in treating diseases today. in order to make medicinal plants more accessible, we need to pay more attention to trust, marketing, and consumption. barcoding and molecular approaches serve this purpose effectively. to compare plant samples available on the market with natural medicinal plants using dna barcoding of correctly identified medicinal species. hence, the sequences used in this study are essential for barcoding vitex agnus-castus. the medicinal species has been correctly identified and can be used as a standard for evaluating the plants available on the market.