بررسی افزایش تولید مشتقات فنلی دارویی گیاه کلپوره (.teucrium polium l) با استفاده از تازن کیتوسان در شرایط in vitro

سابقه و هدف: کلپوره (.teucrium polium l)، گیاهی علفی از تیره نعناع است که مصارف دارویی فراوانی در طب سنتی دارد. در سال‌های اخیر اثرهای دارویی متعدد مانند ضددیابت، ضدسرطان، ضداسپاسم، کاهش‌دهنده چربی و فشار خون آن گزارش شده است. بنابراین کشت این گیاه در شرایط آزمایشگاهی برای حفظ بقاء، تکثیر و افزایش متابولیت‌های ثانویه این گونه ضروریست. از راهکارهای اساسی، استفاده از تازن‌ها در تکنیک کشت بافت گیاهی یکی از پرکاربردترین روش‌ها برای افزایش متابولیت‌های ثانوی-دارویی است. کیتوسان بیوپلیمری است که سبب القای پاسخ‌های دفاعی، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و مسیر فنیل‌پروپانوئید و تجمع ترکیبات فنلی می‌شود. در این پژوهش با هدف بهینه‌سازی تولید متابولیت‌های ثانوی و افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی، اثر تازن زیستی کیتوسان بر برخی ترکیبات فنلی گیاه کلپوره در شرایط کشت در‌شیشه مطالعه شد.مواد و روش‌ها: به این منظور ریزنمونه برگ از گیاه کلپوره نگهداری شده در شرایط هیدروپونیک و تغذیه‌شده با محلول هوگلند، تهیه شد و بعد از سترون کردن با ‌سدیم هیپوکلرید 5% (v/v) و اتانول 70% (v/v)، برش‌های میانی از ریزنمونه برگ تهیه گردید و در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (ms) حاوی غلظت‌های مجزا و تلفیقی هورمون‌های بنزیل آمینو پورین (bap) (1 و 1.5 میلی‌گرم در لیتر) و نفتالن استیک اسید (naa) (0.5 میلی‌گرم در لیتر) قرار داده شد. نمونه‌ها به مدت چهار هفته در شرایط تاریکی و دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. با ظهور نشانه‌های کال‌زایی، نمونه ها به شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند و در پایان هفته ششم، عملیات واکشت پینه‌های القاء شده انجام شد. پینه‌ها با غلظت‌های مختلف (صفر، 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر) تازن زیستی کیتوسان تیمار شدند. پس از گذشت 8 هفته از رشد پینه‌ها، پینه‌های سبز جمع‌آوری و در فریزر منفی 20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. به‌منظور تهیه عصاره نهایی برای سنجش‌های بیوشیمیایی، عصاره گیری از پینه‌های سبز انجام شد و از این عصاره برای اندازه‌گیری مقادیر ترکیبات فنلی (فنل، فلاونوئید، فلاون و اسیدهای فنلی) و فعالیت آنتی‌اکسیدانی به‌روش فعالیت جاروب‌کنندگی رادیکال آزاد dpph و سنجش قدرت کاهشی  frap و سنجش میزان فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز (pal) استفاده شد.نتایج: نتایج حاصل از تجزیه‌وتحلیل داده‌ها نشان داد که کاربرد کیتوسان در چهار غلظت (صفر، 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر) و تمامی تیمارهای هورمونی ( bap1, bap1.5, bap1.5+naa0.5میلی‌گرم در لیتر)، سبب تاثیر افزایشی معنی‌دار در محتوی ترکیبات فنلی و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی و فعالیت آنزیم pal نسبت به نمونه شاهد در پینه‌های سبز القاء شده کلپوره شد. به‌طوری که تیمار همزمان و تلفیقی هورمون bap در غلظت 1.5 میلی‌گرم در لیتر به‌همراه هورمون naa در غلظت 0.5 میلی‌گرم در لیتر به‌همراه تیمار 100 میلی‌گرم در لیتر تازن‌ زیستی کیتوسان در پینه‌های سبز القاء شده کلپوره در کشت درشیشه، موجب بیشینه محتوی مشتقات فنلی (1884.95 برای فنل، 936.65 برای o-دی‌فنل، 1462.28 برای فلاونوئید، 631.07 برای فلاون و 662.41 برای اسیدهای فنلی برحسب میلی‌گرم در 100 گرم وزن‌خشک) گردید. براساس تحلیل آماری داده‌ها و مقایسه میانگین داده‌ها مشخص شد که ظرفیت‌های آنتی‌اکسیدانی اندازه‌گیری شده برمبنای آزمون dpph و frap، به‌ترتیب موجب افزایش 68.34 و 71.92 درصدی نسبت به نمونه شاهد شد. فعالیت آنزیم pal نیز به‌طور قابل‌توجهی افزایش 65.81 درصدی را نسبت به نمونه شاهد در پینه‌های القاء شده کلپوره نشان داد.نتیجه‌گیری: با توجه به اهمیت گیاه دارویی کلپوره، بکارگیری کیتوسان در نقش یک تازن‌زیستی موفق می تواند باعث افزایش سنتز متابولیت‌های ثانوی-مشتقات فنلی و به‌دنبال آن افزایش توان آنتی‌اکسیدانی و افزایش فعالیت آنزیم pal در پینه کلپوره در شرایط in vitro گردد.

chitosan-elicitation of secondary pharmaceutical metabolites production of teucrium polium l. in in vitro condition

background and objectives: teucrium polium l. is a herbaceous plant from the mint family that has many uses in traditional medicine. in recent years, numerous medicinal effects such as anti-diabetes, anti-cancer, anti-spasm, and reducing fat and blood pressure have been reported. therefore, cultivation of this plant under laboratory conditions is necessary to preserve its survival, reproduction, and increased secondary metabolites. among the solutions, elicitors in the plant tissue culture technique are one of the most widely used methods to increase secondary-medicinal metabolites. chitosan, as a biopolymer, induces defense responses, increases antioxidant enzyme activity, and accumulates phenolic compounds. in the present study, the effect of chitosan bio-elicitor was studied on some phenolic compounds of t. polium under in vitro culture to optimize secondary metabolites and increase antioxidant capacity.methodology: leaf explants were prepared from preserved t. polium in hydroponic conditions and fed with hoagland’s solution. after sterilization with sodium hypochlorite 5% (v/v) and ethanol 70% (v/v), middle slices were prepared from the leaf explant and cultured on murashige and skoog (ms) culture medium containing separate and combined concentrations of benzyl amino purine (bap)(1 and 1.5 mg.l-1) and naphthalene acetic acid (naa)(0.5 mg.l-1). the samples were kept for four weeks in the dark at 25 degrees celsius. with callogenesis, the samples were transferred to light conditions of 16 hours of light and 8 hours of darkness. at the end of the sixth week, the induced calli were subcultured. the calli were treated with chitosan at different concentrations (0, 50, 100, and 150 mg.l-1). after eight weeks, green calli were collected. finally, to prepare the final extract for biochemical assays, extraction was done from green calli. the content of phenolic compounds (phenol, flavonoid, flavone, and phenolic acids), antioxidant activity, and phenylalanine ammonialyase (pal) activity was measured.results: according to the results, the application of different concentrations of chitosan (0, 50, 100, and 150 mg.l-1) and all hormonal treatments (bap1, bap1.5, and bap1.5+naa 0.5 mg.l-1) caused a significant increase in the content of phenolic compounds, antioxidant capacity, and pal activity compared to the control samples. so the application of the simultaneous and combined treatment of bap at a concentration of 1.5 mg.l-1 with naa at a concentration of 0.5 mg.l-1, along with the treatment of 100 mg.l-1 of chitosan induced green calli of t. polium in in vitro culture, results in the maximum content of phenolic derivatives (1884.95 for phenol, 936.65 for o-diphenol, 1462.28 for flavonoid, 631.07 for flavone, and 662.41 for phenolic acids). as compared to the control, the antioxidant capacities (measured by dpph and frap assays) increased by 68.34 percent and 71.92 percent, respectively. a significant increase in pal activity (65.81%) was observed in induced calli.conclusion: considering the importance of t. polium as a medicinal plant, chitosan, a successful elicitor, promotes the synthesis of phenolic secondary metabolites. as a result, the increase of antioxidant power and pal activity in the callus of t. polium.