بررسی تاثیر عصاره متانولی برگ گیاه pterocarya fraxinifolia (poir) spach بر بازدارندگی تکثیر و بیان ژن‌های دخیل در آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان انسان mcf-7

سابقه و هدف: بیماری سرطان یکی از عوامل مهم مرگ و میر و سرطان سینه شایع‌ترین بدخیمی در بین زنان است. گیاهان دارویی می‌توانند نقش مهمی در درمان سرطان داشته باشند. امروزه بسیاری از داروهای موثر در درمان سرطان از فرآورده‌های طبیعی استخراج شده از گیاهان بدست می‌آید. هدف از این پژوهش، ارزیابی اثر سمّیت سلولی عصاره متانولی برگ درخت pterocarya fraxinifolia و تاثیر آن بر بیان ژن‌های p21، bid، bcl-2، rb1 و mdm2 در رده سلولی سرطان پستان mcf-7 است.مواد و روش: عصاره‌گیری از 20 گرم برگ خشک شده و پودر شده در معرض هوا به روش خیس کردن (ماسراسیون) با استفاده از متانول خالص و پس از 24 ساعت در شیکر انکوباتور با سرعت 120 دور در دقیقه، دمای 25 درجه سانتی‌گراد و در تاریکی انجام شد. پس از فیلتراسیون و خشک کردن عصاره، 5 میلی‌گرم از ماده خشک حاصل در 1 میلی‌لیتر محیط rpmi-1640 حل شده و بعد از فیلتراسیون دوباره، به‌عنوان استوک برای تهیه غلظت‌های مختلف ذخیره شد. رده‌های سلولی سرطان سینه mcf-7 و hgf-1 به‌عنوان رده سلولی طبیعی در محیط کشت rpmi1640 همراه با fbs 10% (وزنی/حجمی)، آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین، استرپتومایسین 1% (وزنی/حجمی)، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و فشار 5% دی‌اکسیدکربن در انکوباتور کشت شدند. این سلول‌ها به مدت 24 ساعت در مجاورت غلظت‌های مختلف از عصاره تام متانولی برگ گیاه لرگ قرار گرفتند. بقای سلولی با استفاده از آزمون رنگ‌سنجی mtt و بیان ژن‌های دخیل در آپوپتوز (p21، bid، bcl-2، rb1، mdm2) در سلول‌های سرطانی تحت تیمار با غلظت ic25 عصاره گیاه با استفاده از روش real-time pcr ارزیابی شد. استخراج rna از سلول‌های mcf-7 و hgf-1، طبق دستورالعمل کیت rnx-plustm انجام شد. سنتز cdna با استفاده از کیت شرکت فرمنتاز (revertaid first strand cdna synthesis kit) و طبق دستورالعمل آن انجام گردید. در این پژوهش از ژن gapdh به‌عنوان کنترل داخلی استفاده شد.نتایج: نتایج حاصل از آزمون mtt نشان داد که عصاره متانولی برگ درخت لرگ، اثر سمّیت سلولی وابسته به غلظت بر روی سلول سرطان سینه رده mcf-7 داشته و در طی آزمایش با افزایش غلظت دارو اثر سمّیت سلولی در هر دو لاین سرطانی و نرمال افزایش یافت. بالاترین مهار در غلظت‌های 1000 و 1200 میکروگرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد. مقدار ic50 عصاره متانولی برگ pterocarya fraxinifolia برای رده سلولی mcf-7 و hgf-1، به‌ترتیب 452.1 و 479.2 میکروگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد. نتایج حاصل از آزمون بیان ژن نشان داد که بیان ژن p21 در سلول‌های mcf-7 در اثر تیمار عصاره گیاه pterocarya fraxinifolia افزایش داشته و در سلول نرمال تحت تیمار عصاره تقریباً ثابت بوده است. بیان ژن bid در سلول‌های سرطانی تیمار شده با عصاره گیاه افزایش یافت، در صورتی که سلول‌های نرمال تحت تاثیر عصاره کاهش جزئی را در بیان این ژن نشان دادند. در سلول‌های سرطانی اعمال عصاره گیاه سبب کاهش بیان ژن bcl-2 شده اما بیان این ژن در سلول‌های نرمال تحت تاثیر عصاره تغییر چندانی نداشت. در سلول‌های نرمال میزان بیان ژن rb1 تحت تیمار عصاره گیاه تغییر چندانی نکرد اما در سلول‌های سرطانی mcf-7، تیمار عصاره موجب افزایش بیان این ژن شد. بیان ژن mdm2 در سلول‌های سرطانی تحت تیمار عصاره گیاه تقریباً بدون تغییر ماند، در صورتی که در سلول سالم تحت تیمار عصاره، بیان این ژن افزایش اندکی یافت.نتیجه‌گیری: این تحقیق مقدمه‌ای برای رسیدن به کاربرد گیاه pterocarya fraxinifolia در مهار رشد سلول‌های سرطانی است. نتایج حاصل از این پژوهش موید اثر مهاری عصاره متانولی این گیاه بر سلول‌های سرطان پستان است. ازاین‌رو، به نظر می‌رسد با تحقیقات بیشتر در آینده، می‌توان از ترکیبات آن در درمان سرطان استفاده کرد.

investigating the effect of the alcoholic extract of pterocarya fraxinifolia (poir) spach leaves on inhibiting the proliferation and expression of genes involved in apoptosis in human breast cancer cell line

background and objectives: cancer is one of the most serious causes of death, and breast cancer is the most common malignancy among women. medicinal plants can play a vital role in cancer treatment. many effective cancer drugs today are derived from natural plant products. this study evaluates the cytotoxic effect of pterocarya fraxinifolia leaf methanolic extract. it also evaluates its effect on the expression of the p21, bid, bcl-2, rb1, and mdm2 genes in the mcf-7 breast cancer cell line.methodology: extraction was done from 20 grams of dried and powdered leaves exposed to air by the soaking (maceration) method using pure methanol and after 24 hours in an incubator shaker at a speed of 120 rpm, temperature of 25°c and in the dark. after filtering and drying the extract, 5 mg of the resulting dry substance was dissolved in 1 ml of rpmi-1640 medium. after re-filtration, it was stored as a stock to prepare different concentrations. mcf-7 breast cancer cell lines and hgf-1 as a normal cell line were cultured in rpmi1640 medium containing fbs 10% (w/v), penicillin antibiotics, streptomycin 1% (w/v), and at 37°c temperature and 5% carbon dioxide pressure in an incubator. these cells were exposed to various concentrations of methanolic extract from pterocarya fraxinifolia leaves for 24 hours. cell survival rate was assessed with mtt colorimetric assay, and expression of genes involved in apoptosis (p21, bid, bcl-2, rb1, mdm2) in cancer cells treated with ic25 concentration of plant extract was evaluated by real-time pcr technique. rna extraction from mcf-7 and hgf-1 cells was performed according to the rnx-plustm kit instructions. cdna synthesis was performed using fermentase company’s kit (revertaid first strand cdna synthesis kit) and according to its instructions. in this study, the gapdh gene was used as an internal control.results: the results of the mtt assay showed that the pterocarya fraxinifolia (poir) spach leaf methanolic extract had a concentration-dependent cytotoxic effect on mcf-7 breast cancer cells, and during the experiment, with increasing drug concentration, the effect of cytotoxicity increased in both cancer and normal lines and high inhibition was observed at concentrations of 1000 and 1200 μg.ml-1. the ic50 of pterocarya fraxinifolia methanol extract against mcf-7 and hgf-1 cell lines was 452.1 and 479.2 μg.ml-1, respectively. real-time pcr results showed that treatment with the pterocarya fraxinifolia plant extract enhanced the expression of the p21 gene, while expression was nearly constant in extract-treated normal cells. the bid gene expression was increased in cancer cells treated with the plant extract. in contrast, normal cells under the influence of the extract showed a slight decrease in gene expression. the plant extract decreased the expression of the bcl-2 gene in cancer cells, whereas the expression of this gene in normal cells did not change significantly under the extract. the rb1 gene expression was not significantly altered in healthy cells after plant extract treatment but increased in the cancer cell line mcf-7. mdm2 gene expression in cancer cells treated with plant extract remained unchanged, whereas it slightly increased in healthy cells treated with extract.conclusion: this study provides an overview of how pterocarya fraxinifolia extract can inhibit cancer cell growth. this study confirms the inhibitory activity of the plant’s methanolic extract on breast cancer cells. with further investigation, the plant compounds may one day be used to treat cancer.