شناسایی ژن مربوط به آنزیم p450 مسئول تولید آلکالوئید کیلانتیفولین درگیاه chelidonium majus l. با استفاده از مخمّر مهندسی ژنتیک شده pichia pastoris

گیاهان منشا اصلی تولید متابولیت‌های ثانویه با ارزش دارویی بالا می‌باشند. مهمترین عضو این ترکیب‌های با ارزش، آلکالوئیدها با مصارف مختلف دارویی هستند. با توجه به تولید محدود برخی از این مواد در گیاهان، به‌عنوان روش جایگزین، با شناسایی و انتقال ژن‌های مسئول سنتز آنزیم‌های سازنده آلکالوئیدها از گیاهان به میکروارگانیسم‌ها می‌توان به‌صورت تجاری این گونه از مواد دارویی را به‌صورت طبیعی تولید کرد. در این راه، شناسایی ژن‌های مسئول آنزیم‌های سنتزکننده قدم نخست چنین اقدامی است. در بین آنزیم‌های سنتزکننده ترکیب‌های آلکالوئیدی، آنزیم‌های سیتوکروم p450 نقش مهمی دارند. با توجه به وابستگی این آنزیم‌ها به وجود شبکه اندوپلاسمی و خصوصیات گلیکوپروتئینی این آنزیم‌ها، نمی‌توان آنها را در سیستم‌های باکتریایی استاندارد بیان کرد. بنابراین می‌توان از میزبان‌های یوکاریوتی مانند مخمّر یا سلول حشرات برای بیان آنها استفاده کرد. در این تحقیق، با استفاده از توالی آمینو اسیدی شناخته شده کیلانتیفولین سنتاز گیاه شقایق کالیفرنیایی و مقایسه فیلوژنی این توالی با توالی‌های آمینو اسیدی هومولوگ گیاه مامیران بدست‌آمده از پایگاه داده بیوانفورماتیک، به‌صورت نظری شش آنزیم سیتوکروم p450 با درصد هومولوژی بالا مسئول سنتز آنزیم کیلانتیفولین سنتاز در گیاه مامیران (chelidonium majaus l.) شناسایی شد. برای اثبات عملی کارآیی این آنزیم‌ها، ژن‌های آنها در وکتور ppic3.5 کلون شده و بعد با انتقال این وکتورهای نوترکیب به سلول مخمّر pichia pastoris و در اختیار قرار دادن آلکالوئید اسکولرئین، تولید آلکالوئید کیلانتیفولین توسط میکروب‌های انتقال ژن داده شده توسط دستگاه lcms بررسی گردید. نتایج نشان داد که از بین ژن‌های کلون و معرفی شده آن آنزیم‌ها به میزبان مخمّر، تنها آنزیم contig8931 فعالیت کیلانتیفولین سنتازی دارد.

Characterization of P450 enzyme gene responsible for Cheilanthifoline alkaloid in greater celandine (Chelidonium majus L.) by transgenic yeast Pichia pastoris

Plants are the main sources of secondary metabolites with high medical value. The most important member of these valuable compounds are alkaloids with the different drug purposes. Concerning the limited production of some of these metabolites in the plants, these medicinal compounds can be produced naturally and commercially with the identification and transfer of alkaloidsproducing enzymes corresponding plant genes to the microorganisms as an alternative method. In this way, the characterization of the corresponding genes is the first step. Among the different enzymes involved in the alkaloid biosynthesis, the cytochrome P450 enzymes play an important role. Due to the endoplasmic reticulum (ER) localization of these enzymes and their glycoprotein characters, they cannot be expressed functionally in the standard bacterial systems. Consequently, the heterologous expression aimed to verify the enzymatic activity can favorably be performed using the eukaryotic systems, like yeast or insect cells. Herein, in this study, with employing a phylogenic comparison of cheilanthifoline synthase sequence of Eschscholzia californica Cham. and comparing the sequence with the homolog amino acid sequences of Chelidonium majus L. achieved from bioinformatics databases, six cytochrome P450 enzymes responsible for cheilanthifoline synthase in Ch. majus were identified. To prove the efficacy of these enzymes practically, their genes were cloned into the pPIC3.5 vector. Then, these recombinant vectors were transferred to the yeast cell (Pichia pastoris) and the scoulerine alkaloid was given to its media. Finally, the cheilanthifoline alkaloid microbial production by P. pastoris containing the recombinant plasmids was evaluated by LCMS. The results of the present study indicated that among the enzymes genes cloned and introduced to the yeast host, only the Contig8931 enzyme had the cheilanthifoline synthase activity.