مهندسی پروتیین آنزیم اندوگلوکاناز قارچی از طریق ایجاد جهش هدفمند به‌منظور بهبود خصوصیات آنزیمی و بیان آن در مخمر

زمینه: استفاده از سوخت‌های فسیلی باعث افزایش بهای آن و کاهش منابع شده ‌است. لذا منابع تجدیدپذیر انرژی و تولید سوخت‌های زیستی مورد ‌‌توجه ‌قرار‌ گرفته ‌است. ترکیبات سلولزی از مناسب‌ترین مواد اولیه برای تولید سوخت‌های زیستی می‌باشد. تجزیه سلولز تنها توسط میکروارگانیسم‌هایی که حاوی آنزیم سلولاز هستند، انجام‌پذیر است که مهم‌ترین آن‌ها قارچ trichoderma reesei می‌باشد. روش‌ها: توالی نوکلیوتیدی آنزیم‌ اندوگلوکاناز ii که از کلیدی‌ترین آنزیم‌های این کمپلکس‌ و آغازگر حمله به زنجیره سلولزی است، از روی توالی آمینواسیدی آن در قارچt.reesei براساس ترجیح کدونی میزبان یعنی مخمر پیکیاپاستوریس سنتز شد. به‌منظور تولید آنزیم‌های بهینه و کاهش زمان تولید و بهای آنزیم از مهندسی پروتیین استفاده می‌شود و از انواع آن ایجاد‌ جهش‌ هدفمند است که در آن جایگزینی آمینواسیدها صورت‌می‌گیرد. در این تحقیق با کمک روش ایجاد جهش‌ هدفمند، دو جهش در ژن آنزیم اندوگلوکاناز ii از طریق pcr ایجاد شد که در آن دو سیستیین آزاد شماره 169 و 393 به‌ترتیب به آمینواسیدهای والین و هیستیدین تبدیل‌شدند. سپس این ژن جهش‌یافته به پلازمید‌بیانی ppink? وارد و جهت تکثیر به باکتری اشرشیاکلای و سپس از طریق الکتروپوریشن به مخمر پیکیاپاستوریس منتقل‌شد.یافته‌ها: ایجاد دوجهش مذکور بر روی این ژن از طریق تعیین توالی تایید‌ شد. حضور آنزیم پس‌ از بیان ژن موردنظر در محیط bmmy، با تست دی‌نیتروسالیسیلیک‌اسید و ژل sds-page اثبات‌گردید.نتیجه‌گیری: با بررسی خصوصیات بیوشیمیایی نشان داده ‌شد که دو جهش ایجادشده به‌طور همزمان در مقایسه با آنزیم فاقد جهش، باعث کاهش قدرت کاتالیتیکی و پایداری حرارتی و افزایش میل ترکیبی آنزیم و سوبسترا شده‌ است.