تاثیر اندازه ریزنمونه بر تولید زیست توده و ویژگی‏ های کالوس در کشت درون شیشه ‏ای سرخدار اروپایی (taxus baccata l.) و اقیانوس آرام (t. brevifolia nutt.)

سابقه و هدف:پاکلی‌تاکسل یکی از پرمصرف‌ترین داروها در درمان سرطان است که در مقادیر بسیار کم (0.01 – 0.03 درصد وزن خشک) در پوست درختان نادر گونه‏های taxus وجود دارد. امروزه موفقیت در کشت و تولید کالوس‏های با کمیت و کیفیت در شرایط درون‌شیشه‌ای‌ به منظور تولید حداکثری متابولیت‌های ثانویه دارویی و جلوگیری از انقراض گونه‏های گیاهی ارزشمند از اهمیت ویژه‏ای برخوردار است. در این راستا، اندازه ریزنمونه کشت بافتی به دلیل تعیین توانایی بازتولیدی، تاثیر قابل ملاحظه‎ای بر میزان زیست‌توده کالوس و کیفیت آن دارد. از این‌رو، این پژوهش با هدف معرفی اندازه بهینه‌ ریزنمونه‌های ساقه دو گونه سرخدار اروپایی و اقیانوس آرام در تولید کالوس با کمیت و کیفیت بیشتر انجام شد.مواد و روش‌ها در این تحقیق، از بافت ساقه دو گونه سرخدار taxus baccata و t. brevifolia به عنوان ریزنمونه برای کشت بافت و تولید کالوس استفاده شد. ریزنمونه‏های ساقه هر دو گونه سرخدار پس از حذف قسمت انتهایی برگ‌ها، به صورت مجزا در پنج گروه با اندازه‌های 2–1.5، 2.5–2، 3–2.5، 3.5–3 و 4–3.5 سانتی‏متر تهیه شدند. کلیه ریزنمونه‏ها پس از ضدعفونی با اتانول (70 درصد)، هیپوکلریت سدیم (1.5 درصد) و آنتی‏بیوتیک سفوتاکسیم (200 میلی‏گرم در لیتر)، روی محیط کشت b5 جامد کشت و در اتاق رشد در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و تاریکی نگهداری شدند. صفات مورد مطالعه شامل میزان زیست‌توده کالوس تولیدی به تفکیک گونه و اندازه ریزنمونه، 28 روز پس از کشت ریزنمونه‏ها ارزیابی شد. همچنین ویژگی‏های مورفولوژیک کالوس‌های حاصل از هر گونه شامل نوع بافت کالوس‌ با سه ساختار پنبه‌ای، نرم و مخلوط (ترکیبی از پنبه‌ای و نرم)، رنگ کالوس‌ شامل سفید، قهوه‌ای و مخلوط (ترکیبی از سفید و قهوه‌ای) بررسی گردید. شدت ترشح ترکیبات فنولی براساس شدت رنگ در محیط کشت از صفر تا پنج (فاقد، خیلی‌کم، کم، متوسط، زیاد و خیلی‌زیاد) امتیازدهی شد. آزمایش به صورت فاکتوریل با دو عامل گونه در دو سطح و اندازه ریزنمونه در پنج سطح در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی اجرا شد. تجزیه آماری با استفاده از روش‏های تجزیه واریانس و مقایسه میانگین با آزمون دانکن برای داده‌های کالوس‌زایی و آزمون کای‏اسکور برای داده‌های ترکیبات فنولی انجام شد. همچنین از همبستگی پیرسون به منظور ارزیابی ارتباط بین اندازه ریزنمونه و زیست‌توده و ترکیبات فنولی استفاده شد.یافته‌هابراساس نتایج، کالوس‌های حاصل از ریزنمونه‌های با طول کمتر از 2.5 سانتی‌متر در گونه t. brevifolia دارای 33% وزن تر بیشتری در مقایسه با t. baccata بود. افزایش طول ریزنمونه از 2–1.5 به 3–2.5 سانتی‌متر سبب افزایش 2.6 برابری زیست‌توده کالوس گونه  t. baccataو 1.5 برابری در t. brevifolia شد. ترشح ترکیبات فنولی نیز در ریزنمونه‌های با طول کمتر از 2.5 سانتی‌متر در گونه  t. brevifolia14 درصد کمتر از t. baccata مشاهده شد. با افزایش طول ریزنمونه‏ها به 3–2.5، 3.5–3 و 4– 3.5 سانتی‌متر ترشح ترکیبات فنولی به ترتیب 4، 6 و 15% در t. brevifolia در مقایسه با t. baccata بیشتر بود. نتایج نشان داد، کالوس‌های حاصل از ریزنمونه‌های t. baccata و t. brevifolia به ترتیب دارای 82 و 27% بافت پنبه‌ای، 2 و 52% بافت نرم و 16 و 21%  بافت مخلوط بودند. بیشترین درصد کالوس‌های سفید رنگ با 63% کالوس به t. baccata تعلق داشت و بافت مخلوط و قهوه‌ای به ترتیب در %30 و 7% از کالوس‏ها مشاهده شد. در حالی ‌که تنها 37% از کالوس‌های  t. brevifoliaسفید رنگ بودند و 33% و 30% به ترتیب مخلوط و قهوه‌ای رنگ بودند. نتایج همچنین حکایت از وجود همبستگی متوسط 0.57 و 0.40 به ترتیب بین اندازه ریزنمونه با زیست‌توده تولیدی در گونه t. baccata و t. brevifolia از یکسو و همبستگی ضعیف 0.23 و 0.25 بین اندازه ریزنمونه با شدت ترشح ترکیبات فنولی در دو گونه مورد مطالعه داشت. نتیجه‌گیرینتایج نشان داد امکان افزایش معنی‏دار زیست‌توده کالوس با کمترین میزان ترکیبات فنولی از ریزنمونه‏های ساقه دو گونه سرخدار با افزایش طول معین در اندازه ریزنمونه میسر است. همچنین با در نظر گرفتن زیست‌توده تولیدی و ویژگی‌های کالوس مشخص شد که طول 2.5–2 سانتی‌متر به دلیل تولید زیست‌توده کالوس بیشتر از یکسو و ترشح ترکیبات فنولی کمتر از سوی دیگر به عنوان بهینه اندازه ریزنمونه ساقه در کشت بافت دو گونه مورد مطالعه پیشنهاد شد.

effect of explant size on callus biomass production and characteristics of european yew (taxus baccata l.) and pacific yew (t. brevifolia nutt.) under in vitro culture

background and purpose: paclitaxel is one of the most widely used drugs in cancer treatment, and it is found in tiny amounts (0.01-0.03% dw) in the bark of rare taxus trees. nowadays, success in the culture and production of optimal callus with high quality and quantity under in vitro conditions is critical to produce maximum secondary medicinal metabolites and prevent the extinction of valuable plant species. in this regard, the tissue culture’s size significantly affects callus biomass and quality due to determining the reproductive ability. therefore, the present research was conducted to introduce the optimal size of the stem explants for two european and pacific yew species to produce more quantity and quality callus.methodology: in the present study, the stem tissue of two species of yew, taxus baccata and t. brevifolia, were used as explants for tissue culture and callus production. the stem explants of both species of yew were prepared after removing the end part of the leaves, separately in five groups with lengths of 1.5-2, 2-2.5, 2.5-3, 3-3.5, and 3.5-4 cm. all explants were sterilized using ethanol (70%), sodium hypochlorite (1.5%), and cefotaxime antibiotic (200 mg l-1), cultured on solid b5 culture medium and kept in the growth room at 25°c and dark. the studied traits, including the production of callus biomass by species and explant size, were evaluated 28 days after explant culture. also, the morphological characteristics of calli obtained from each species, including the type of callus tissue in three categories: cottony, soft, and mixed (combination of cottony and soft), the callus color, white, brown, and mixed (combination of white and brown) were investigated. the secretion intensity of phenolic compounds was scored based on the color intensity in the culture medium from zero to five (none, deficient, low, medium, high and very high).the experiment was carried out as a factorial study with two species factors at two levels and an explant size at five levels in the form of an unbalanced, completely randomized basic design. statistical analysis was performed using analysis of variance and mean comparison with duncan’s test for callus biomass data and chi-score test for phenolic compounds data. pearson’s correlation was also used to evaluate the relationship between explant size and biomass and phenolic compounds.results: based on the results, the callus obtained from explants with a length of less than 2.5 cm in t. brevifolia showed 33% higher fresh weight compared to t. baccata. increasing the length of the explants from 1.5-2 to 2.5-3 cm caused a 2.6-fold increase in the callus biomass of t. baccata and a 1.5-fold increase in t. brevifolia. the secretion of phenolic compounds in explants with a length of less than 2.5 cm was observed in t. brevifolia, 14% less than in t. baccata. by increasing the length of explants to 2-5.3, 3-3.5, and 3.5-4 cm, the secretion of phenolic compounds increased by 4%, 6%, and 15%, respectively, in t. brevifolia compared to t. baccata. according to the results, calli obtained from t. baccata and t. brevifolia explants had 82 and 27% cotton texture, 2 and 52% soft texture and 16 and 21% mixed texture, respectively. the highest percentage of white calli, with 63% of calli, belonged to t. baccata, 30% and 7% with mixed and brown tissues, respectively. only 37% of t. brevifolia calli showed white, 33% and 30% mixed and brown, respectively. the results also indicated a moderate correlation of 0.57 and 0.40 between the explant size and the production biomass in t. baccata and t. brevifolia species, respectively. also, a weak correlation of 0.23 and 0.25 was detected between the explant size and the intensity of the secretion of phenolic compounds in the two studied species. conclusion: the results showed that it is possible to significantly increase the callus biomass with the lowest amount of phenolic compounds from the stem explants of two yew species with a specific length increase in the explant size. also, regarding the productive biomass and callus characteristics, it was found that the length of 2.5-2.5 cm is suggested as the optimal size of the stem explant in the tissue culture of the two studied species due to the production of more callus biomass and less secretion of phenolic compounds.