تاثیر الیسیتور قارچی سلولاز بر روی فعالیت آنتی‌اکسیدانی و آنزیم‌های آنتی اکسیدانی در کشت سوسپانسیون سلولی شیرین بیان (glycirrhiza glabra)

سابقه و هدف: شیرین‌بیان (glycirrhiza glabra l.)، گیاهی چند‌ساله از خانواده fabaceae، سرشار از متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی است که برای درمان طیف وسیعی از بیماری‌های انسانی استفاده می‌شود. امروزه از روش‌های مختلف کشت بافت برای افزایش بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه مانند دفاع گیاه و تحریک پاسخ استرس در سلول‌های گیاهی به کمک الیسیتورها استفاده می‌شود. قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی، سلولاز تولید می‌کنند و سلولاز می‌تواند به عنوان محرکی برای تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی استفاده شود. هدف از این تحقیق، اثر آنزیم سلولاز به‌دست‌آمده از قارچaspergilus niger بر میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی (روش dpph) و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در شرایط کشت سوسپانسیون سلولی شیرین‌بیان است.مواد و روش‌هابذر شیرین‌بیان از منطقه سمیرم استان اصفهان جمع‌آوری شد. بذرها پس از ضدعفونی در یک محیط ms 1/2 کشت داده شدند. به منظور القای کالوس، هیپوکوتیل و کوتیلدون در محیط mms حاوی تنظیم‌کنند‌های رشد (دو میلی‌گرم در لیتر ba و نیم میلی‌گرم در لیتر naa) با ساکارز 3% و آگار 0/7 درصد کاشته شدند. نیم گرم کالوس فیبری تولید شده در زیر هود استریل به ارلن‌های حاوی 50 سی‌سی محیط کشت مایع mms حاوی دو میلی‌گرم در لیتر هورمون ba و نیم میلی‌گرم در لیتر هورمون naa منتقل و در انکوباتور شیکردار با سرعت 150 دور در دقیقه، دمای 25 درجه سانتیگراد و تاریکی قرار داده شد. در روز نوزدهم پس از کشت، آنزیم سلولاز با غلظت 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر به هریک از ارلن‌ها در زیر هود استریل اضافه گردید. سپس برداشت در فواصل زمانی صفر (شاهد)، 24‌، 48 و 72 ساعت پس از افزودن الیسیتور انجام شد. کالوس‌های دیر واکشت شده نیز به عنوان یک تیمار در نظر گرفته شد. تجزیه آماری به صورت طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. صفات مورد بررسی شامل: فعالیت آنزیم‌های اکسیدانی کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز، پلی‌فنل اکسیداز و گایاکول پراکسیداز و فعالیت آنتی‌اکسیدانی (روش dpph) بودند. برای تعیین روابط بین فعالیت آنتی‌اکسیدانی و فعالیت آنزیم‌ها از تجزیه همبستگی استفاده شد و برای تعیین روابط بین فواصل زمانی صفر، 24، 48 و 72 ساعت افزودن الیسیتور بر فعالیت‌های آنزیمی، از تجزیه رگرسیون استفاده گردید.نتایج اثر آنزیم سلولاز بر تمامی صفات به‌جز سوپراکسید دیسموتاز در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی (روش dpph) در 72 ساعت پس از تیمار، بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت. تجزیه همبستگی بین صفات نشان داد که همبستگی بین آنزیم کاتالاز با آنزیم‌های پلی‌فنل اکسیداز و گایاکول پراکسیداز و همبستگی بین آنزیم گایاکول پراکسیداز با آنزیم پلی‌فنل اکسیداز مثبت و معنی‌دار بود. فعالیت آنتی‌اکسیدانی نیز همبستگی مثبت و معنی‌داری با فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پلی‌فنل اکسیداز نشان داد. نتایج تجزیه رگرسیون رابطه مثبت و معنی‌داری بین فواصل زمانی افزودن الیسیتور بر فعالیت‌های آنزیمی (بجز سوپراکسید دیسموتاز و اسکوربات پراکسیداز) و فعالیت آنتی‌اکسیدانی نشان داد.نتیجه‌گیریاستفاده از آنزیم سلولاز مشتق از قارچ aspergilus niger در شرایط کشت سوسپانسیون سلولی باعث افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌‌اکسیدانی در شیرین‌بیان شده است. آنزیم سلولاز در شرایط کشت سوسپانسیون سلولی باعث ایجاد تنش سلولی می‌شود و این تنش باعث تحریک سازوکار‌های دفاعی گیاه مانند آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی می‌گردد. همبستگی مثبت و معنی‎داری بین فعالیت آنتی‌اکسیدانی (روش dpph) و فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند پلی‌فنل‌اکسیداز و کاتالاز مشاهده شد که نشان‌دهنده تاثیر مثبت عامل قارچی در تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه و افزایش ظرفیت مهار رادیکال‌های آزاد در شرایط کشت سوسپانسیون سلولی شیرین‌بیان است. با توجه به رابطه خطی معنی‌دار بین فواصل زمانی افزودن الیسیتور بر فعالیت‌های آنزیمی (بجز سوپراکسید دیسموتاز و اسکوربات پراکسیداز) و فعالیت آنتی‌اکسیدانی، مدت زمان 72 ساعت به‌عنوان بهترین فاصله زمانی اعمال الیستور قارچی تعیین شد.

the effect of fungal cellulase elicitor on antioxidant activity and enzymes in licorice cell suspension culture (glycyrrhiza glabra l.)

background and objectives: licorice (glycyrrhiza glabra) is a perennial plant from the fabaceae family rich in bioactive secondary metabolites used to treat many human diseases. recent advances in plant tissue culture techniques have shown promising results in improving productivity and allowing the gradual replacement of whole plant culture as a source of valuable secondary metabolites. today, various tissue culture methods are used to increase the performance of secondary metabolites by strengthening plant defense and stimulating stress response in plant cells with the help of elicitors. plant pathogenic fungi produce cellulase, which is used as an elicitor to stimulate the production of secondary metabolites in plant cell suspension culture conditions. this research aimed to study the effect of cellulase enzyme obtained from aspergillus nigar fungus on the amount of antioxidant activity (dpph method) and antioxidant enzyme activity in licorice cell suspension culture conditions. methodology: licorice seeds were collected from the semirom region, isfahan province, iran. seeds were cultured in the ½ ms medium after disinfection. in order to induce callus, the hypocotyl and cotyledon were cultured in mms medium containing growth regulators (2 mg/l ba and 0.5 mg/l naa) with 3% sucrose and 0.7% agar. then 0.5 g of fibrous callus produced under a sterile hood was transferred to erlenmeyer flasks containing 50 cc of mms liquid culture medium containing 2 mg/liter of ba hormone and 0.5 mg/liter of naa hormone and was placed in a shaker incubator with a speed of 150 rpm, a temperature of 25oc and darkness. on the 19th day after cultivation, cellulase enzyme with a 200 μg/ml concentration was added to each erlens under a sterile hood. then, harvesting was done at zero-time intervals (control) 24, 48 and 72 hours after adding the elicitor. late cultured calli were also considered as a treatment. statistical analysis was carried out using a completely randomized design with three replications. data were collected for dpph and all antioxidant enzyme activities such as catalase, superoxide dismutase, polyphenol oxidase, ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase. a regression analysis was used to determine the relationship between dpph and antioxidant enzyme activities at the time interval after adding the elicitor. results: the effect of cellulase enzyme on all traits except superoxide dismutase was significant (p<0.01). the activity of antioxidant enzymes and antioxidant activity (dpph method) within 72 hours of applying treatment showed the most significant increase compared to the control. correlation between traits showed that catalase enzyme had a positive and significant correlation with polyphenol oxidase and guaiacol peroxidase enzymes. similarly, the guaiacol peroxidase enzyme positively correlated with the polyphenol oxidase enzyme (p<0.01). antioxidant activity (dpph method) also showed a positive and significant correlation with catalase, polyphenol oxidase and catalase enzymes. the result of simple regression analysis using dpph and all antioxidant enzyme activities as dependent variables and the time interval after adding the elicitor as independent variables showed that all dpph and all enzyme activities (except superoxide dismutase and ascorbate peroxidase) had increased by 72 hours after adding the elicitor.conclusion: the use of cellulase enzyme derived from aspergillus nigar fungus in the conditions of cell suspension culture increases the antioxidant activity (dpph method) and the activity of oxidant enzymes. therefore, it was concluded that the cellulase enzyme caused cell stress in the conditions of cell suspension, and this stress caused the stimulation of the plant’s defense mechanisms, such as antioxidant enzymes. a positive and significant correlation was observed between the antioxidant activity and some antioxidant enzymes, such as polyphenol oxidase and catalase, which indicates the positive effect of the fungal elicitor in stimulating the production of secondary metabolites and increasing the potential of inhibiting free radicals in licorice plant cell suspension culture conditions. the dpph and all enzyme activities (except superoxide dismutase and ascorbate peroxidase) were increased 72 hours after adding the elicitor.