همسانه‌سازی، شناسایی و بررسی بیان ژن stylopine synthase (sts) در مامیران کبیر (chelidonium majus)

سابقه و هدف:سنگوئینارین (sanguinarin) یکی از متابولیت‌های ثانویه مهم از خانواده آلکالوئیدهای گروه بنزیل ایزوکوئینولین می‌باشد که به‌طور گسترده در بیشتر گیاهان خانواده پاپاوراسه(papaveraceae) ازجمله مامیران کبیر (chelidonium majus) وجود دارد. سنگوئینارین دارای خواص بسیاری مانند خاصیت ضد میکروبی قوی، ضدقارچی و ضدالتهاب است. کاربرد محرک های غیرزنده یکی از راهکارهای موثر القای تولید و افزایش متابولیت های ثانویه می باشد. محرک هایی مانند متیل‌جاسمونات از طریق تحریک سیستم دفاعی گیاه موجب القاء بیوسنتز و انباشت متابولیت‌های ثانویه می‌شوند. ازآنجایی ‌که گزارشی مبنی بر جداسازی cdna کدکننده ژن sts در مسیر بیوسنتز آلکالوئید سنگوئینارین در گیاه مامیران وجود ندارد، در این تحقیق اقدام به جداسازی طول کامل این ژن گردید تا فرصتی برای شناسایی و بررسی مسیرهای بنزیل‌ایزوکویینولین ‌که تاکنون شناخته نشده‌اند فراهم گردد. همچنین، پس از جداسازی ژن مذکور، الگوی بیانی این ژن تحت تاثیر محرک غیرزنده متیل جاسمونات در جهت بهبود تولید آن بررسی شد.مواد و روش ها:در این تحقیق، در مرحله اول شناسایی و جداسازی cdna کدکننده ژن stylopine synthase (sts) از اندام ریشه گیاه مامیران کبیر انجام شد. این ژن یکی از ژن‌های مسیر تولید سنگوئینارین می‌باشد و واکنش تبدیل (s)-cheilanthifoline به (s)- stylopine در پل متیلوکسی را سنتز می‌کند که متعلق به زیر خانواده cyp719 است. در مرحله بعدی میزان بیان ژن sts با اعمال تیمار متیل جاسمونات با غلظت 100 میکرومولار در چهار سطح (محلول‌پاشی، آبیاری، ترکیب محلول‌پاشی+ آبیاری و شاهد بدون متیل جاسمونات) در اندام‌های مختلف (برگ، ریشه و ساقه) این گیاه در زمان‌های مختلف پس از تیمار (6، 24 و 48 ساعت) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در چهار تکرار در شرایط گلخانه‌ای بررسی شد.نتایج: جداسازی cdna ژن sts در دو مرحله انجام شد. ابتدا توالی ناقص (1000 جفت باز) جداسازی شد و بعد با طراحی آغازگرهای جدید بر اساس اطلاعات بدست آمده از توالی اولیه، طول کامل ناحیه کدکننده ژن استیلوپین‌سنتاز (1500 جفت باز) جداسازی و با موفقیت در پلاسمید ptg19-t همسانه‌سازی شد. پس از توالی‌یابی و انجام اصلاحات لازم، توالی ژنی به‌دست ‌آمده با شماره دسترسی ky550671.2 در پایگاه اطلاعاتی ncbi ثبت گردید. با بررسی خصوصیات توالی و مطالعه روابط فیلوژنتیکی، مشخص شد که cyp719a3 حاصل فعالیت ژن sts (ژن همسانه‌سازی و توالی یابی شده) متعلق به خانواده پروتئینی p450 است. نتایج تجزیه واریانس بیانگر اثر معنی‌دار تیمار متیل ‌جاسمونات در زمان‌های مختلف در بافت‌های متفاوت بر بیان ژن sts گیاه مامیران (در سطح p≤0.01) بود. بیشترین میزان بیان ژن sts در تیمار ترکیب محلول‌پاشی+ آبیاری با متیل ‌جاسمونات در زمان 48 ساعت پس از اعمال تیمار در اندام ریشه بود. مقایسه میانگین بیان نسبی ژن sts نشان داد که میزان بیان این ژن در ریشه، برگ و ساقه مامیران کبیر متفاوت بود، به‌طوری‌که در ریشه 1.5 برابر برگ و 2.5 برابر ساقه بود. بیان بالای ژن sts در ریشه مامیران نشان‌دهنده موثر بودن اندام گیاهی در میزان فعالیت ژن می باشد و از سوی دیگر کاربرد محرک متیل ‌جاسمونات می تواند نقش موثری در افزایش بیان آن داشته باشد.نتیجه گیری: متیل‌ جاسمونات سبب افزایش بیان ژن sts در مسیر بیوسنتزی سنگوئینارین شد، به‌طوری‌که بیشترین افزایش بیان در ریشه گیاه مامیران مشاهده گردید. ازاین‌رو، توالی ژن کدکننده sts در مسیر بیوسنتز سنگوئینارین و الگوی بیانی آن در گیاه مامیران کبیر می‌تواند در زمینه مهندسی مسیر این متابولیت ارزشمند استفاده شود.

cloning, identification and expression analysis of stylopine synthase )sts) gene in chelidonium majus l.

background and objectivessanguinarin is an important secondary metabolite of the benzyl isoquinoline alkaloids, which is widely found in papaveraceae family plants such as chelidonium majus. sanguinarin has many properties such as antimicrobial, antifungal, and anti-inflammatory. the use of abiotic elicitors is one of the effective ways to induce and increase of secondary metabolites. the elicitors such as methyl-jasmonate induce the biosynthesis and accumulation of secondary metabolites by stimulating the plant’s defense system. since there is no report on the isolation of cdna encoding the stylopine synthase in sanguinarine biosynthesis pathway in chelidonium majus, the full length of this gene was isolated to provide an opportunity to identify and investigate the pathways of benzylisoquinoline that have not been known so far. also, the expression pattern of this gene was surveyed under the treatment of methyl-jasmonate to improve its production.methodology in this research at the first stage, the cdna encoding the stylopine synthase gene (sts) was identified and isolated from the root of chelidonium majus. sts is one of the genes in sanguinarin biosynthesis pathway that converts (s)-cheilanthifoline to (s)-stylopine in the methyloxy bridge, which belongs to cyp719 subfamily. in the next stage, the expression pattern of sts gene was examined in a completely randomized design with four replicates by applying methyl-jasmonate (concentration of 100 μm) at four treatment levels (foliar, irrigation, foliar + irrigation and without methyl-jasmonate as control) in different organs (leaf, root and stem) and different sampling times (6, 24 and 48 hours after methyl-jasmonate treatment) in a pot experiment under greenhouse condition.results isolation of sts gene cdna was done in two steps. at first, the incomplete sequence (1000 bp) was isolated, and then, by designing new primers based on the information from the primary sequence, the full length (1500 bp) of the coding region of gene was isolated and successfully cloned into ptg19-t plasmid. after sequencing and necessary modifications, the obtained gene sequence was registered in the ncbi database with the accession number ky550671.2. by evaluating the sequence characteristics and studying the phylogenetic relationships, it was determined that cyp719a3, the product of the sts gene, belongs to the p450 protein family. the results of variance analysis showed the methyl-jasmonate treatment affect significantly (p≤0.01) sts gene expression at different times in different organs of chelidonium majus. the highest level of gene expression was observed in methyl-jasmonate foliar spraying + irrigation 48 hours after treatment in the root. the mean comparison showed that the expression level of sts gene was different in the root, leaf and stem of chelidonium majus, so it was 1.5 and 2.5 times higher in the root than leaf and stem, respectively. the high expression of the sts gene in the root of chelidonium majus indicates the effectiveness of the plant organ in the level of gene activity, on the other hand, the use of methyl-jasmonate could play an effective role in increasing gene expression. conclusion methyl-jasmonate increased the expression of sts gene in the sanguinarine biosynthesis pathway so that the highest expression was observed in the root. therefore, the sequence of the gene encoding stylopine synthase in the sanguinarine biosynthesis pathway and its expression pattern in chelidonium majus can be used in the pathway engineering of this valuable metabolite.