شناسایی بررسی بیان برخی از micrornaهای حفاظت شده دخیل در مسیر بیوسنتز ویتانولیدها در پنیرباد (withania somnifera)

سابقه و هدف: پنیرباد (withania somnifera) متعلق به خانواده سیب‌زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه های غده ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینa، ویتانولیدd، ویتانولیدa و ویتانون ها می‌باشند. ویتافرین a و ویتانون ها بیشتر در برگ های پنیرباد وجود دارند، در حالی‌ که ویتانولید aعمدتاً در ریشه تولید می شود. بیوسنتز این متابولیت‌ها به ژن های فارنسیل پیروفسفات (fpp)، سیکلوآرتنول سنتاز (cas)، استرول متیل ترانسفراز (smt1) و ‌هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم a ردوکتاز (hmgr)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و rnaهای غیرکدکننده مانند mirna ها در تنظیم  بیان این ژن ها و آنزیم ها نقش دارند. ژن های mirna ها، rnaهای کوچک با طول 18- 24 نوکلئوتید هستند که هیچ پروتئینی کد نمی کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می کنند. این گروه از rnaهای غیر رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می کنند و به‌عنوان تنظیم‌کننده های منفی بیان ژن در یوکاریوت ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی mirna‌های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.مواد و روش‌ها: در این پژوهش، برای انجام آنالیز hplc از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز elsd، مدل c-650 استفاده شد. به منظور شناسایی mirna های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده های rna-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم‌افزار c-mii از blastn با معیارهای تا چهار عدم تطابق و e- value < 10 استفاده شد. ساختار ثانویه mirnaهای متمایز به وسیله نرم‌افزار mfold تعیین شد. ژن‌های هدف mirnaهای نامزد با استفاده از psrnatarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: e-value < 1.0e^-5، تعداد جایگاه های مورد هدف برابر2، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین 10-11 نوکلئوتید، بیشترین عدم تشابه برابر 2 و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن های هدف از ابزارblastx علیه پایگاه داده پروتئینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه‌برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ w1 (7629245)،w3 (7629241) و w4 (7629244) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از real-time pcr برای ارزیابی بیان mirna5021 و ژن هدف آن smt1 و mirna5140 استفاده شد و تجزیه داده های حاصل از بیان با استفاده از روش 2^δδct- انجام شد. یافته‌ها: با توجه به تجزیه‌های آماری داده های حاصل از hplc، بین مقدار ویتافرین آ در سه ژنوتیپ (w1، w3 و w 4) از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. در بین بافت های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ w3 و کمترین به ریشه w1 اختصاص داده شده است. برای شناسایی mirnaها ساختار دوم توالی ها با سرور mfold پیش بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (mfe) از 15- تا 130.4- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن 42.98- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش rt-qpcr نشان داد که میزان بیان نسبی mir5021 در ریشه w1، w3 و w4 نسبت به شاهد (بافت برگ w1)، 1.16، 1.37 و 1.17 به ترتیب افزایش بیان و در برگ w3 و w4 به ترتیب 3.1 و 3.7 برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن smt1 در سه ژنوتیپ w. somnifera برای ریشه w1، w3و w4 به ترتیب 7.7، 2.8 و 4 برابر کاهش و در برگ w3 و w4 به ترتیب 2.48 و 1.82 برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی mir5140 در برگ w3، 1.57 و برای w4 بدون تغییر و در ریشه,wi w3 و w4نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای mirna5021 و mirna5140 در بین  سه ژنوتیپ برای هر یک از این ژن ها اختلاف معنی‌داری وجود ندارد.نتیجه ‌گیری: در مجموع با توجه به نقش تنظیمی mirnaهای شناسایی شده در این مطالعه، می توان از این ژن ها در شناسایی بهتر و دقیق تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.

identification and investigation of the expression of some conserved micrornas involved in the biosynthesis pathway of withanolides in ashwagandha

background and purpose: withania somnifera, known as indian ginseng, is a small evergreen shrub that grows in tropical and subtropical regions and belongs to the solanaceae family. the major constituents of w. somnifera are withanolides, including withafrin a, withanolide d, withanolide a, and withanones. withanolide a and withanones are primarily synthesized in the roots, while withafrin a and withanones are mainly produced in the leaves. the genes responsible for the appropriate metabolic pathways, such as farnesyl pyrophosphate (fpp), cycloartenol synthase (cas), sterol methyltransferase (smt1), and hydroxymethylglutaryl coenzyme a reductase (hmgr) along with non-coding rnas are essential for the biosynthesis of these compounds. these non-coding rnas play critical roles in controlling gene expression and enzyme activity. in general, mirnas are a class of small regulatory rnas which negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding target mrnas for mrna cleavage or inhibition of mrna translation. many investigations have shown that mirnas play an essential role in various biological and metabolic processes in plants. this study was aimed to the identification and investigation of the expression of some conserved micrornas involved in the biosynthesis pathway of withanolides in w. somnifera. methodology: for hplc analysis, a high-performance liquid chromatography system coupled with an elsd detector, model c-650, was employed. conserved mirnas in w. somnifera were identified using blastn with a criterion of up to four mismatches and an e-value < 10, based on rna-seq data and homology analysis conducted by c-mii software. the secondary structure of several mirnas was determined using mfold software. the target genes of these potential mirnas were predicted using psrnatarget, applying the following criteria: in order to determine the function of the target genes, the blastx program was used against the protein database with the following parameters: e-value > 1.0e-5, a range of missing central bases between 10 and 11 nucleotides. samples were collected from leaf and root tissues of three genotypes of w. somnifera (w1 - 7629245, w3 - 7629241, and w4 - 7629244) during the flowering stage. three technical and biological replicates were used for data collection. the expression levels of mirna5021 and its target gene smt1 and mirna5140 were analyzed using real-time pcr. the 2-δδ ct method was employed to analyze the expression data. results: according to the statistical analysis of the hplc data, there was no statistically significant difference in the amounts of withaferin-a among the three genotypes (w1, w3, and w4). among the examined tissues, the leaf of w3 exhibited the highest amount, while the root of w1 had the lowest amount. to identify the mirnas in w. somnifera, the transcriptome sequences were compared to plant mirnas using the mirbase website for blast homology search. the results obtained from the rt-qpcr method showed that the relative expression levels of mir5021 in w1 roots were 1.16, 1.37, and 1.17 times higher compared to the control (w1 leaf tissue), while they were 1.3 and 3.7 times lower in w3 and w4 leaves, respectively. in the roots of the three genotypes of w. somnifera, the expression of the smt1 gene decreased by 7.7, 2.8, and 4.0 fold, respectively. however, in the leaves of genotypes w3 and w4, the expression increased by 2.48 and 1.82 times, respectively, compared to the control. the statistical analysis for mirna5021 and mirna5140 revealed that in the leaves of w3, the relative expression of mir5140 was 1.57, while in w4, it remained unchanged. in the roots of w1, w3, and w4, there was a decrease in mir5140 expression by seven, nine, and three times, respectively, compared to the control. conclusion: in general, regarding the regulatory role of the identified mirnas in the present study, these genes could be used to better and more accurately identify the withanolides biosynthetic pathway.