بهینه‌ سازی تولید آمیلاز در باکتری همزیست با اسفنج‌های دریایی

پیشینه و اهداف: آنزیم‌ ها پروتئین هایی هستند که به‌طور انتخابی تمام واکنش های متابولیک را در موجودات زنده کاتالیز می کنند. میلیو ن‌ها آنزیم توسط پروکاریوت ها و یوکاریوت ها تولید می شوند. اسفنج های دریایی با ارگانیسم‌ های مختلفی مانند باکتری ها، قارچ ها، ویروس ها، پروتوزوآها و موجودات تک سلولی بنام جلبک ها همزیستی دارند و طبیعت میان‌کنش اسفنج‌ ها با میکروب ها بسیار متنوع است.حدود 40 درصد از حجم توده اسفنج از باکتری‌های همزیست تشکیل شده است. حداقل 32 شاخه باکتریایی در اسفنج های دریایی شناخته شده است که توسط روش های وابسته به کشت و مستقل از کشت جداسازی شده اند. میکروارگانیسم های همزیست با اسفنج ها منبع ترکیبات مختلفی هستند که در گذشته گمان می رفت توسط اسفنج ها تولید می شوند که اکنون مشخص شده که توسط این میکروارگانیسم های همزیست مشتق شده‌ اند. چنانچه باکتری های تولیدکننده این ترکیبات جداسازی شوند می‌ توان جهت تولید انبوه آنها را کشت داد. هدف از این تحقیق جداسازی باکتری ه‌ای تولیدکننده آنزیم آمیلاز از اسفنج های دریایی و بهینه سازی شرایط رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر می‌ باشد. باکتری های همزیست با اسفنج با استفاده از روش رقیق‌سازی سریالی و آنالیز های افتراقی در باکتری های جداشده انجام شد. فعال ترین ایزوله با استفاده از روش‌ های کیفی و کمی هیدرولیز نشاسته انتخاب شد.روش‌ها‌: ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی با استفاده از کتاب برجی و سیستماتیک باکتری ها انجام شد. آنالیز های افتراقی با انجام تست های کاتالاز، گرم، tsi، سیمون سیترات، اورنیتیل دکربوکسیلاز، لیزین دکربوکسیلاز، vp ، mr، ایندول و sim انجام شد. غربالگری اولیه جهت جداسازی ایزوله‌ های تولیدکننده آنزیم آمیلاز به ترتیب، با انجام آزمایش‌ های پلیت حاوی نشاسته و دی نیتروسالیسیلیک اسید (dns) صورت گرفت. جهت بهینه‌سازی تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر (ss1) با استفاده از محیط کشت m1 حاوی غلظت‌ های مختلف nacl (2 تا 14 درصد)انجام شد. برای یافتن ph بهینه از محیط کشت m1 با ph های مختلف 4تا 8 استفاده شد و پس ازگذشت زمان انکوباسیون فعالیت آمیلازی آن ها مورد آزمایش قرار گرفت. ایزوله ss1 در محیط کشت m1 در 28 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز جهت تهیه توده سلولی مناسب برای استخراج dna کشت داده شد. استخراج dna با استفاده از کیت استخراج dna از باکتری های گرم مثبت، انجام شد. تکثیر ژن 16s rrna با استفاده از dna استخراج شده و آغازگرهای f27  و r1492 انجام شد. محصول pcr به دست آمده توالی یابی شده و توالی‌ ها مورد بررسی قرار گرفت. توالی ژن 16s rrna به دست آمده با استفاده از نرم افزار blast موجود در داده پایگاه ژنی ncbi همردیف شد و در سطح جنس با استفاده از نرم افزار clustal-x شناسایی شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار mega 6.06 و روش neighbor-joining رسم گردید. صحت درخت فیلوژنی با بوت استرپ 1000 تکرار صورت گرفت.یافته‌ها: آنالیزهای بیوشیمیایی نشان داد که هر سه ایزوله کاتالاز و گرم مثبت هستند و هیچکدام h2s تولید نمی کنند. تمام ایزوله‌ ها برای آزمایش های tsi، mr و vp منفی بودند. توالی‌های 16s rrna بدست آمده از فعالترین ایزوله تولیدکننده آنزیم آمیلاز نشان می دهد که این ایزوله متعلق به جنس باسیلوس می‌ باشد. شرایط بهینه رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر به شرح زیر می‌ باشد: غلظت 12 درصد nacl، دمای 35 درجه سانتی‌گراد و ph 12 می باشد. بیشترین فعالیت آمیلازی مشاهده شده در شرایط بهینه رشد ایزوله برتر مورد مطالعه 109 واحد آنزیمی بود (هر واحد آنزیمی عبارتست از میزان آنزیمی که یک میکروگرم گلوکز را در یک دقیقه آزاد کند).نتیجه‌گیری: نتایج نشان می دهند که تولید آنزیم به شرایط رشد باکتری بستگی دارد و در مطالعات بعدی لازم است ژن کدکننده آنزیم آمیلاز تکثیر و جهت تولید انبوه آنزیم در میزبان مناسب کلون شود.

Optimization Amylase Production in Bacteria from Marine Sponges

Background and Objectives: Enzymes are selective proteins that catalyze all metabolic reactions found in living organisms. Millions of enzymes are produced by prokaryotes and eukaryotes. Marine sponges have developed a enormous quantity of diverse microorganisms such as bacteria, fungi, viruses, protozoa, and single-celled algae and the nature of the sponge-microbe interaction is diverse. Marine sponge’s symbiotic bacteria can comprise as much as 40% of sponge tissue volume. At least 32 bacterial phyla and candidate phyla were described from marine sponges by both cultivation-dependent and cultivation-independent techniques. Symbiotic microorganisms in sponges can be sources of various natural products, because metabolites previously ascribed to sponges have recently been demonstrated to be biosynthesized by symbionts. If symbiotic microorganisms from which some natural products are derived can be cultured, the microorganism could be used in a mass production of the bioactive comopounds. The goal of this research is isolation of Amylolytic bacteria from marine sponges and optimization of bacterial growth and amylase production in most amylolytic isolate. Symbiot bacteria were isolated using serial dilution method and differential analyses done for isolated bacteria. Most effective isolate was selected by using qualitative starch hydrolysis method.Methods: Morphological and biochemical characteristics were studied using Bergey’s manual of systematic bacteriology. Differential analyses were performed by catalase and Gram test TSI, H2S, VP, MR tests. Preliminary screening and quantification of amylase activities were analysed in selected isolates by starch agar plate and dinitrosalicylic acid (DNS) method respectively. In order to optimize the enzyme production, the fermentation process was carried out under M9 medium using various sodium chloride concentrations (2–14%). To evaluate the effect of pH on the production of Amylase, the best amylase producer isolate was cultured at M9 medium with different pH rang 4-8. After incubation time it was subjected to amylase activity assay. Isolate SS1 was grown in M1 medium at 28°C for 7 days. DNA extraction was done using Cinnapure DNA Kit for isolation of DNA from gram positive bacteria. PCR amplification of 16S rRNA gene was performed, the specific actinomycete primers, F27 and R1492 were used to amplify 16S rDNA. The resultant 16S rRNA gene sequences were aligned manually with corresponding almost complete sequences. The 16S rRNA gene sequence search was performed using the BLAST program available from the National Centre for Biotechnology Information (NCBI) and the isolate was identified to generic level Using the CLUSTAL-X Multiple Sequence Alignment Program (Strasburg, France), The Phylogenetic tree was constructed by Neighbor-Joining method using MEGA 6.06. The reliability of the phylogenetic tree was tested by bootstrap analysis using 1,000 replicates.Findings: Biochemical analyses showed that all tests were catalase and Gram positive none of them produced H2S and TSI, MR, VP tests were negative. According to 16S rRNA sequences result the most effective isolate was belong to Bacillus genus and Optimum growth condition was found at 12% NaCl concentration, 35˚C temperature and pH 12. Maximum amylase activity in optimum condition was 109 Unit (one Unit is amount of enzyme that release one microgram of glucose in a minute).Conclusion: The results showed that enzyme production is related to growth of bacteria conditions and the amylase gene should amplify from selected isolate and clone in suitable host for more studies.