کلونینگ و بررسی بیان ژن hcpd هلیکوباکتر پیلوری

زمینه و هدف: ژن hcpd به عنوان یکی از ژن های کد کننده خانواده پروتئین های غنی از سیستئین هلیکوباکتر پیلوری است. این دسته از پروتئینها سبب تحریک سیستم ایمنی میزبان و تولید آنتی بادی میگردند. هلیکوباکتر پیلوری مستقر در معده انسان سبب بیماریهای گوارشی نظیر: زخم دوازدهه، گاستریت مزمن و سرطان معده میشود. هدف از این مطالعه، تکثیر، جداسازی و همسانه سازی ژن hcpd هلیکوباکتر پیلوری در وکتور pcdna3.1() و بررسی بیان آن در سیستم یوکاریوتی است. روش کار: در این مطالعه تجربی، dna ژنومی از هلیکوباکتر پیلوری با استفاده از کیت استخراج dna تخلیص شد. سپس ژن hcpd به روش pcr تکثیر و ژن مورد نظر پس از خالص سازی از روی ژل، در وکتور ptz کلون گردید. ساب کلونینگ ژن hcpd در وکتور بیانی یوکاریوتی pcdna3.1() انجام شد. صحت مراحل کلون سازی به ترتیب با سه روش pcr، هضم آنزیمی با آنزیم های bamhi و ecorv و نهایتاً تعیین توالی مورد بررسی قرار گرفت. سازه بیانی ساخته شده توسط منفذزایی الکتریکی به سلولهای cho منتقل شد. بیان ژن در سلولهای cho با تکنیکهای rtpcr و sdspage آنالیز شد.یافته ها: نتایج pcr نشان دهنده تکثیر قطعه 933 جفت بازی مربوط به ژن hcpd بود. کلونسازی این ژن در وکتور ptz، با موفقیت انجام شد و پلاسمید نوترکیب ptzhcpd بدست آمد. هضم آنزیمی و تعیین توالی، موید درستی ساب کلونینگ ژن و ایجاد سازواره نهایی pcdna3.1()hcpd است. بیان ژن hcpd در سیستم یوکاریوتی انجام و محصول پروتئینی این ژن روی ژل sdspage مشاهده شد. نتیجه گیری: سازواره ptzhcpd به عنوان منبعی از ژن chpd هلیکوباکتر پیلوری برای تحقیقات آینده نظیر تولید پروتئین نوترکیب و ایجاد واکسن نوترکیب در سیستم های مختلف میباشد. از طرف دیگر، بیان موفق ژن hcpd با کمک وکتور نوترکیب pcdna3.1()hcpd در سلولهای جانوری cho، نشان‫دهنده پتانسیل این وکتور به عنوان واکسن نوترکیب علیه هلیکوباکتر پیلوری می باشد.

Cloning and Expression Study of the hcpD Gene of Helicobacter pylori

Background Objectives: hcpD gene in Helicobacter pylori is a member of cysteinerich proteins family which triggers the host's immune system and antibody production. H. pylori is found in human's stomach and causes digestive diseases such as duodenal ulcer, chronic gastritis and stomach cancer. The objectives of this study were to isolate, amplify and clone H. pylori's hcpD gene in pcDNA3.1 () vector and to study its expression in eukaryotic system.Methods: H. pylori genomic DNA was isolated by extraction kit. The hcpD gene was amplified using PCR reaction and then purified from gel, followed by pTZ cloning. Subcloning of hcpD was performed in pcDNA3.1 () eukaryotic expression vector. The accuracy of cloning steps was investigated through PCR, enzymatic digestion by BamHI and EcoRV enzymes, and sequencing, respectively. Transfer of expression construct into CHO cells was done by electroporation. The gene expression in these cells was analyzed using RTPCR and SDSPAGE.Results: PCR results showed amplification of a 933bp segment related to hcpD gene. Successful cloning of the gene in pTZ vector and construction of pTZhcpD recombinant vector were achieved. Enzymatic digestion and sequencing confirmed the correctness of subcloning and creation of pcDNA3.1 ()hcpD construct. hcpD was expressed in eukaryotic system, and its protein product was observed on SDSPAGE gel.Conclusion: pTZhcpD construct can be used as a source of H. pylori's hcpD gene for future research, like production of recombinant protein and vaccine in different systems. Furthermore, successful expression of the gene using pcDNA3.1 ()hcpD in CHO animal cells shows the potential of vector as a gene vaccine against H. pylori.