کلون، بیان و تخلیص پروتیین P647-153هموفیلوس آنفلوانزا

زمینه و هدف: همـوفیلوس آنفلوانزا، باسیل گرم منفی است که بخشی از میکروفلور نازوفارنکس را در اغلب افراد تشکیل داده و سویه های مختلف آن در دو گروه کپسولدار (قابل طبقه بندی) و بدون کپسول (غیرقابل طبقه بندی) مورد مطالعه قرار می گیرد. پروتیین غشا خارجی p6، نوعی ایمونوژن حفاظت شده و پایدار درمیان سویه های فاقد کپسول و نیز سویه‏های کپسولدار هموفیلوس آنفلوانزا می باشد و خود بعنوان کاندید مناسبی جهت واکسیناسیون علیه هموفیلوس آنفلوانزا مطرح گردیده است. هدف از این مطالعه، تولید و تخلیص آنتی ژن نوترکیب p6 به عنوان یک پروتیین حامل در واکسنهای کونژوگه می باشد.روش کار: قطعه ای به طول324 جفت باز از بخش انتهای ژن کد کننده پروتیین p6در حامل پلاسمیدی pjet1.2 و متعاقبا در pet28a(+) کلون شد. القای تولید پروتیین با یک میلی مولار iptg صورت گرفت و تخلیص آن با حل کردن اجسام سلولی در اوره، جذب با رزین نیکل، حذف اوره با شیب کاهشی اوره در محلول های شستشو و نهایتا جمع آوری پروتیین نوترکیب به شکل محلول در ایمیدازول انجام شد. حذف ایمیدازول با دیالیز در برابر بافرفسفات نمکی صورت پذیرفت. پروتیین نوترکیب p647-153 با استفاده از آنتی سرم پلی کلونال خرگوشی ضد هموفیلوس آنفلوانزا با استفاده از روش وسترن بلات تایید گردید. یافته ها: پروتیین نوترکیب p647-153در میزبان de3 ) e. coli bl21 ) با موفقیت بیان و تخلیص گردید (حدود 4 میلی گرم درهر لیتر کشت مایع lb). ساختار آنتی ژنی پروتیین نوترکیب p6 نیز با استفاده از ایمونوبلاتینگ تایید شد.نتیجه گیری: نتایج وسترن بلات به موازات نتایج تعیین توالی، حاکی ازصحت تولید پروتیین p647-153 نوترکیب و حفظ نسبی ساختار اپیتوپی آن می باشد.