بیان دومین متصلشونده به رسپتور )rbd )پروتئین اسپایک کرونا ویروس متصل به انتهای کربوکسیلی انتروتوکسین کلستریدیوم پرفرنژنس (cpe-c )در مخمر پیکیاپاستوریس

مقدمه: برای افزایش iga موکوزال میتوان از انتقال آنتیژن به صورت اینترانازال اقدام کرد. یکی از مشکلاتی که در هنگام استفاده از این روش وجود دارد نفوذپذیری پایین مخاط بینی به عوامل آنتیژنیک می باشد. در این مطالعه برای رفع این مشکل از cpe-c یا قسمت انتهای کربوکسیلی انتروتوکسین کلستریدیوم پرفرنژنس استفاده گردید. به همین منظور سازه فیوژن cpe-c-rbd در میزبان باکتریایی کلون و برای بیان پروتئین در ژنوم میزبان مخمری درج گردید. اهداف: هدف نهایی از این مطالعه، ساخت و بیان سازه فیوژنی است که بتوان از آن به عنوان واکسن مخاطی کرونا ویروس جهت ایجاد ایمنی مناسب در میزبان استفاده کرد. مواد و روش ها: پس از ساخت سازه بیانی، سازه در وکتور مخمری ppiczαa کلون شد. ترانسفورماسیون باکتری́f10top با پلاسمید نوترکیب، استخراج پلاسمید و ترانسفورماسیون مخمر 33x با پلاسمیدهای نوترکیب خطی شده انجام گردید. کلونهای مثبت پس از کشت شبانه برای مراحل کشت بیانی استفاده شدند. تغلیظ پروتئین و سپس وسترنبلات و ecl جهت تایید ترشح پروتئین در محیط کشت مخمر انجام گرفت. نتایج: الکتروفورز روی ژل آگارز نشاندهنده ساخت موفق سازه ژنی cpe-c-rbd بود. نتایج pcr colony باکتری́f10top و مخمر پیکیاپاستوریس پس از طی مراحل ترانسفورماسیون به ترتیب نشان دهنده کلونینگ موفق پلاسمید نوترکیب rc-ppic در باکتری ́f10top و نیز اینتگریشن موفق پلاسمید نوترکیب در ژنوم مخمر بود. وسترنبلات تاییدکننده بیان موفق پروتئین فیوژن cpe-c-rbd در مخمر پیکیاپاستوریس بود.نتیجه گیری: سازه cpe-c-rbd بعد از کلون در میزبان باکتریایی با موفقیت در ژنوم میزبان مخمری درج و بیان گردید و می توان پس از بهبود بیان پروتئین فیوزشده از آن به عنوان یک کاندید واکسن مخاطی covid19- برای کارآزمایی پیش بالینی بر روی حیوانات استفاده کرد.

expression of receptor binding domain (rbd) from coronavirus spike protein fused to carboxylic terminal of clostridium perfringens enterotoxin (c-cpe) in pichia pastoris

background: to enhance mucosal iga, administering intra-nasal antigen transfer may be considered. one challenge with this approach is antigenic factors' limited penetration of nasal mucosa. this research utilized c-cpe, the carboxylic end-section of the enterotoxin clostridium perfringens. specifically, the rbd-c-cpe fusion structure was cloned in a bacterial host and integrated into the yeast host genome for protein expression.  objectives: the primary aim of this investigation is to develop methods: following the construction of the expression structure, it was then cloned into the yeast vector a coronavirus vaccine that can elicit sufficient immunity in the host.  methods: materials ppiczαa: subsequently, the top10f bacterium was transformed with the recombinant plasmid, and plasmid extraction was carried out. this was followed by the transformation of yeast strain x33 with linearized recombinant plasmids. positive clones obtained from the overnight sowing process were utilized for the expression stages. to confirm protein secretion in the yeast medium, the protein concentration, western blot, and ecl were performed.  results: agarose gel electrophoresis results indicated the successful construction of the rbd-c-cpe gene. colony pcr analysis of both top10f bacteria and pichia pastoris yeast post-transformation confirmed the effective cloning of the recombinant ppic-rc plasmid in top10f bacteria and the successful integration of the recombinant plasmid into the yeast genome, respectively. moreover, western blot analysis provided conclusive evidence of the successful expression of the rbd-c-cpe fusion protein in pichia pastoris yeast.  conclusions: the rbd-c-cpe has been effectively integrated and produced within the yeast host genome following its cloning in a bacterial host. further enhancing the fused protein's expression can serve as a potential candidate for preclinical trials on animals for a covid-19 mucosal vaccine.