بهینه‌‌سازی الایزای مبتنی بر آنتی‌ژن her2 و مبتنی بر سلول برای شناسایی بیوسیمیلار تراستوزومب

هدف: الایزا یک روش حساس، اختصاصی، تکرار‌پذیر و سریع است که جهت سنجش فعالیت بیولوژیک آنتی بادی‌ها استفاده می‌شود. تراستوزومب یک آنتی بادی مونوکلونال انسانی ضد گیرنده‌ی فاکتور رشد اپیدرمی انسانی 2 (human epidermal growth factor receptor 2, her2) است که از شروع مسیر پیام‌رسانی پایین‌دستی جلوگیری می کند. تراستوزومب می تواند به‌عنوان کنترل مثبت در تعیین فعالیت آنتی بادی های ضد گیرنده her2 مورد استفاده قرار گیرد. از دلایل محتمل ایجاد پس‌زمینه در الایزا، شستشو و بلوک کردن ناکافی است که لازم است بهینه شود. هم‌چنین، در الایزای غیر مستقیم جهت صرفه‌جویی در میزان آنتی‌ژن، ضروری است حداقل میزان آنتی‌ژن که می‌تواند منحنی تیتراسیون مناسب تراستوزومب را بدهد، تعیین شود. هدف از این مطالعه، بهینه سازی روش الایزا برای بیوسیمیلار تراستوزومب (آریوتراست trade;، شرکت آریوژن فارمد) بود.مواد و روش ها: در این مطالعه، متغیرهایی مانند دفعات شستشو، نوع ماده بلوک‌کننده و غلظت آنتی‌ژن در الایزای مبتنی بر her2 و نوع سلول her2 منفی و ماده‌ی بلوک‌کننده در الایزای مبتنی بر سلول بررسی گردید.یافته ها: در الایزای مبتنی بر her2 مشخص گردید، شستشوی 5 مرتبه‌ای بین مراحل مختلف الایزا به‌صورت معناداری باعث ایجاد پس زمینه کم‌تری نسبت به شستشوی 3 مرتبه‌ای می‌شود. به‌علاوه، میزان اتصال غیر اختصاصی در حضور مسدود‌کننده‌ی شیر خشک 5 درصد به‌طور معناداری ازbsa 1 و 3 درصد کم‌تر بود. کم‌ترین میزان her2 که منجر به ایجاد منحنی تیتراسیون مناسب برای آریوتراست شد، غلظت 0.1 میکروگرم در میلی‌لیتر بود. هم‌چنین، در الایزای مبتنی بر سلول نشان داده شد که استفاده از رده‌ی سلولی mdamb231 به عنوان رده‌ی سلولی her2 منفی به‌طور معنی‌داری منجر به کاهش پاسخ پس‌زمینه در مقایسه با mcf7 شد. هم‌چنین، در این نوع الایزا محلول bsa 3 درصد به عنوان مسدود‌کننده‌ی مناسب انتخاب شد.نتیجه گیری: داده های به‌دست آمده، می تواند برای طراحی الایزای مبتنی بر her2 و مبتنی بر سلول آنتی بادی‌های ضد گیرنده her2 و قطعات آن مورد استفاده قرار گیرد.

Optimization of HER2-based and cell-based ELISA for detection of trastuzumab biosimilar

Introduction: ELISA is a sensitive, specific, reproducible and fast method to quantify the biological activity of antibodies. Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody against HER2 receptors which prevents the initiation of downstream signaling pathway. Trastuzumab can be used as a positive control in the ELISA experiments for antiHER2 antibodies. Additionaly, insufficient washing and blocking can be the cause of background in the ELISA experiment that is necessary to be optimized. As we do not want to waste antigen, it is also important to determine the last dilution of antigen that can give good titration curve for trastuzumab. The aim of this study was to optimize ELISA method for trastuzumab biosimilar (AryoTrust trade;, Aryogen pharmed).Materials and Methods: In this study, different variables including the number of washing cycle, the blocking agent and antigen concentration in HER2based ELISA and the type of HER2 negative cell line and the blocking agent in cellbased ELISA were studied.Results: It was demonstrated that 5 times washing between different steps of HER2based ELISA causes significant lower nonspecific background as compared to 3 times washing. Moreover, the nonspecific binding was significantly lower in the presence of % 5 skim milk as blocking agent as compared to BSA %1 or BSA %3. In addition, the lowest HER2 concentration which gives good titration curve for trastuzumab was 0.1 mu;g/ml. In cellbased ELISA experiment, it was demonstrated that the use of MDAMB231 as negative HER2 cell line caused significant lower background than MCF7. Furthermore, BSA 3% was chosen as proper blocking agent.Conclusion: The results of this study can be used for development of HER2 and cellbased ELISA for anti HER2 antibodies and its fragments.