مطالعه و بررسی اثرات مهار ژن‌هایacka ، pta و poxb به وسیله‌ی rna ی آنتی‌سنس روی ترشح استات و بیان اینترفرون بتای نوترکیب در باکتری اشریشیا‌کلای

هدف: اشریشیا‌کلای یکی از رایج‌ترین سیستم باکتریایی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب دارویی محسوب می‌شود. تولید بیش از حد اسید استیک (استات) به عنوان یک محصول ناخواسته‌ی جانبی، مانعی بر سر راه استفاده از ای. کلای به شمار می‌رود. در این پژوهش، برای حل مشکل ترشح اضافی استات، از یک روش مهندسی متابولیک مبتنی بر فناوری آنتی‌سنس استفاده شد.مواد و روش‌ها: یک پلاسمید نوترکیب حاوی توالی کد‌کننده اینترفرون نوترکیب بتای انسانی و سه قطعه آنتی‌سنس بر علیه ژن‌های استات کیناز، فسفوترانس استیلاز و پیروات اکسیداز طراحی شد. اثرات ایجاد شده توسط آن بر فیزیولوژی سلولی و بیان اینترفرون بتا و غلظت استات در باکتری ای. کلای بررسی شد.یافته‌ها: غلظت mrna ژن‌های هدف‌گیری شده در سویه‌ی حاوی قطعات آنتی‌سنس در مقایسه با سویه‌ی کنترل کم‌تر شده بود. با استفاده از فناوری آنتی‌سنس، غلظت استات در محیط کشت کاهش یافته بود. بیان قطعات rna آنتی‌سنس تاثیر نامطلوبی بر روند رشد سلولی ایجاد نکرد. به علاوه، بیشینه‌ی مقدار اینترفرون بتای نوترکیب در سویه‌ی کنترل شده با فناوری آنتی‌سنس در مقایسه با سویه‌ی کنترل بیش‌تر شده بود.نتیجه‌گیری: استفاده از فناوری آنتی‌سنس به منظور مهندسی متابولیک چرخه‌ی استات در ای. کلای موفقیت‌آمیز بود. فناوری توصیف شده در این پژوهش، قابلیت به کار گرفته شدن برای تولید سایر پروتئین نوترکیب دارویی، را دارا می‌باشد.

Effects of ackA, pta and poxB inhibition by antisense RNA on acetate excretion and recombinant beta interferon expression in Escherichia coli

Introduction: Escherichia coli (E.coli) is one of the most widely used hosts for the production of recombinant proteins. The main problem in getting high product yields and productivity is the accumulation of acetic acid (acetate) as an unwanted metabolic byproduct. In this study, an antisensebased strategy as a metabolic engineering approach was employed to hamper the acetate excretion problem.Materials and Methods: A recombinant plasmid containing the encoding genes for human recombinant interferon beta (rhINF beta;) and three antisense oligonucleotides against acetate kinase, phosphotransacetylase and pyruvate oxidase B was designed. The effects of recombinant plasmid on the cell physiology, rhINF beta; production and acetate excretion were studied in E. coli.Results: The mRNA levels of the targeted enzymes were lowered in antisenseregulated cells compared to the control cells. The concentration of acetate in culture media was decreased due to the constructed plasmid. The expression of antisense RNA did not affect the cell growth, negatively. Besides, the rhINF beta; production was enhanced in antisenseregulated strain compared to the control plasmid without antisense genes.Conclusion: Application of an antisense strategy on the acetate pathway was successful in metabolically engineering E. coli. This enhancement of production yield by antisense technology suggests that this strategy may be successfully applied to high cell density fermentations of E. coli expression system to overexpress other recombinant proteins.