تولید موش ناک اوت Spata19 با استفاده از فناوری Crispr/Cas9

هدف: ژن spata19 در مراحل تکوینی بیضه و برخی ارگان‌ها بیان دارد، ولی تاکنون عملکرد آن فقط در بیضه بررسی شده است. در این مطالعه با بهره‌گیری از روش crispr/cas9 nickase ضمن تولید موش ناک اوت spata19 برای مطالعات بعدی در سایر ارگان‌ها، مسیری موثر برای تولید این موش‌ها ارائه دادیم.مواد و روش‌ها: با استفاده از وکتور px335 و grnaهای طراحی شده، پلاسمیدهای crispr/cas9 nickase سنتز شدند. هر کدام از پلاسمیدها به باکتری e.coli ترانسفورم شدند و انتخاب کلونال انجام شد. پس از استخراج پلاسمیدها از باکتری، به نسبت مساوی با یکدیگر ترکیب شدند. مخلوط حاصل به پیش هسته‌ی نر تزریق شد. زیگوت حامل پلاسمید به اویداکت موش فاستر منتقل شد. پس از طی دوران بارداری موش‌های متولد شده مورد آنالیز قرار گرفتند.یافته‌ها: با استفاده از روش crispr/cas9 nickase موش‌های ناک اوت با حذف 2 نوکلئوتیدی ایجاد کردیم. این حذف در سه سطح dna، rna و پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. حذف 2 نوکلئوتیدی در سطح dna و rna به وسیله توالی‌یابی تایید شد. با ترجمه‌ی توالی rna جهش یافته مشخص شده که این حذف کدون خاتمه زودرس ایجاد می‌کند. در بررسی فنوتیپی نیز عقیم بودن موش‌های هموزیگوت نر (spata19/) تایید شد.نتیجه‌گیری: با تولید موش‌های ناک اوت spata19 ما یک پروتکل برای تولید موش‌های ناک اوت ارائه می‌دهیم. این موش‌ها می‌تواند به عنوان موش‌های نابارور و برای بررسی ویژگی‌های بیش‌تر ژن spata19 به کار گرفته شود.

Generation of global Spata19 knockout mouse using CRISPR/Cas9 nickase technology

Introduction: SPATA19 gene is expressed in developmental stages of testis and some organs, but so far its function has only been examined in the testis. In this study, we provided an effective pathway for the generation of these mice using new CRISPR / Cas9 nickase method while generating Spata19 knockout mice for future studies in other organs.Materials and Methods: CRISPR / Cas9 nickase plasmids were synthesized using pX335 vector and designed gRNAs. So, each plasmid was transformed into E.coli and clonal selection was performed. The plasmids extracted from the bacteria were mixed in equal proportions and injected into the male pronucleus. Correspondingly, the zygotes carrying the plasmid were transferred to Oviduct of Foster mice. After pregnancy extent, born mice were analyzed.Results: We generated global knockout mice using CRISPR/Cas9 nickase technology. This deletion was examined at three levels of DNA, RNA and protein. Generated 2 nucleotides deletion was confirmed by sequencing at three levels of DNA, RNA and protein. By translating the mutated RNA sequence, it was determined that this deletion could cause premature stop codon. Phenotypic analysis confirmed infertility of male homozygous mice (Spata19 /).Conclusion: By generating Spata19 knockout mice, we present a protocol for generation of knockout mice. These mice could be applied as the infertile male mice and also for further characterization of Spata19 gene.