ساخت سویه بیانی پیکیا پاستوریس مولد قطعه‌ی تک‌زنجیره‌ای ناحیه‌ی ‌متغیر آنتی‌بادی علیه ناحیه خارج سلولی Epcam

هدف: مولکول چسباننده سلول های اپیتلیال (epcam) در سطح سلول های توموری اپیتلیال به طور فزاینده ای بیان می شود. بنابراین epcam یک آنتی ژن با ارزش در درمان هدفمند محسوب می شود. استفاده از آنتی بادی های منوکلونال رویکردی جذاب در درمان هدفمند سرطان است. محدودیت های آنتی بادی های منوکلونال نظیر اندازه ی بزرگ منجر به توسعه قطعات تک زنجیره ای ناحیه متغیر آنتی بادی (scfv) شد. پیکیا پاستوریس به علت انجام فرایندهای پس از ترجمه و قیمت ارزان به عنوان میزبانی مناسب در بیان پروتئین های نوترکیب در مقیاس بالا مورد توجه است. در این مطالعه، پیکیا پاستوریس بیان کننده scfv علیه قسمت خارج سلولی (epex) epcam ساخته شد.مواد و روش ها: ژن بهینه شده ی کدونی مولد پروتئین anti-epex-scfv در سایت های آنزیمی xhoi و xbai وکتور ppiczαb وارد شد. صحت سازه نوترکیب به کمک توالی یابی و آنالیز آنزیمی تایید شد. سازه نوترکیب با کمک الکتروپوراسیون در سویه gs115 وارد شد. کلون های مثبت با کمک pcr و با به کارگیری سه جفت پرایمر ارزیابی شدند.یافته ها: صحت سازه نوترکیب با استفاده از آنزیم های hindiii وbamhi (باندهای 2788 و 1537 جفت باز) هم چنین xhoi و xbai (باندهای 3506 و 819 جفت باز) تایید شد. کلون های نوترکیب با کمک pcr با مشاهده دو باند (2200 و 1321 جفت باز) زمانی که دو پرایمر aox استفاده شد، هم چنین یک باند (968 جفت باز) زمانی که پرایمر aox و پرایمر اختصاصی ژن استفاده شد، تایید شد. هنگامی که دو پرایمر اختصاصی ژن به کار گرفته شد، یک باند (751 جفت باز) مشاهده شد.نتیجه گیری: این یافته ها ساخت سویه مهندسی شده را تایید می کند. پروتئین anti-epex-scfv می تواند انتخابی مناسب در زمینه ی ایمنی درمانی سرطان باشد.

Construction of recombinant Pichia pastoris expressing singlechain antibody fragment against extracellular domain of EpCAM

Introduction: Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is highly expressed on epithelial tumors. So, EpCAM is a valuable antigen for targeted therapy. Using monoclonal antibodies (mabs) is an attractive approach for targeted cancer therapy. Importantly, limitations of intact mabs including large size led to the development of antibody fragments such as single chain fragment variable (scfv). Pichia pastoris is considered as a suitable host for largescale production of recombinant proteins because of posttranslation modification system and low cost. Here, the Pichia expressing a scfv against EpCAM extracellular domain (EpEX) was constructed.Materials and Methods: The codon optimized gene encoding anti-EpEX-scfv protein was cloned in the XhoI and XbaI sites of the pPICZαB vector. The recombinant plasmid was confirmed by restriction enzyme analysis and sequencing. The constructed plasmid was integrated into GS115 strain by electroporation. Positive clones were evaluated by PCR using three sets of primers.Results: Restriction enzyme analysis utilizing HindIII and BamHI (2788, 1537 bp bands), as well as XhoI, XbaI (3506, 819 bp bands) confirmed construction of recombinant pPICZαBanti EpEX scfv. In this way, PCR based screening results of integrants showed two bands (2200 and 1321 bp), when AOX1 primer set was used as well as one band (968 bp) when the 3´ insertspecific primer paired with 5´ AOX1 primer. There was one band (751 bp) in PCR result of confirmed integrants when insertspecific primer set was utilized.Conclusion: These findings imply that the engineered strain was constructed. The anti-EpEX-scfv protein can be used as a potential candidate in cancer immunotherapy.