ساخت سویه بیانی مخمر نوترکیب مولد Epex به‌عنوان انتخابی مناسب در تشخیص و درمان سرطان

هدف: مولکول چسبان سلول اپیتلیال (epcam) یک گلیکوپروتئین غشایی است که بیان آن در اکثر تومورهای با منشا اپیتلیالی افزایش می یابد و لذا می تواند در شناسایی و درمان سرطان ها با کمک روش های ایمونولوژیکی به عنوان یک هدف مناسب به کار گرفته شود. لذا تولید نوترکیب این پروتئین به فرم طبیعی حایز اهمیت می باشد. در دو دهه ی گذشته مخمر پیکیا پاستوریس به دلیل دارا بودن مزایای هر دو سیستم بیانی پستاندار و پروکاریوتی، به عنوان میزبان رایج در تولید پروتئین های نوترکیب مطرح بوده است. در این مطالعه پیکیا بیان کننده بخش خارج سلولی epcam ساخته شده است.مواد و روش ها: ژن بهینه شده ی کدونی مولد پروتئین epex در محل های برشی آنزیم های xhoi و xbai وکتور ppiczαb همسانه سازی شد. سازه نوترکیب با کمک الکتروپوراسیون در سویه gs115 وارد شد. کلون های مثبت با کمک pcr و با استفاده از جفت پرایمر مربوط به ژن aox1 ارزیابی شدند.یافته ها: صحت ساخت سازه نوترکیب ppiczα-bepex با استفاده از توالی یابی و آنالیز آنزیمی با استفاده از آنزیم های xhoi و xbai (باندهای 3506 و 843 جفت باز) هم چنینbamhi (باندهای 3651 و 698 جفت باز) تایید شد. نتایج حاصل از غربالگری بر پایه pcr، زمانی که دو پرایمر مربوط به ژن aox1 به کار گرفته شد، نشان دهنده ی حضور دو باند (2200 و 1345 جفت باز) در کلون های نوترکیب بود.نتیجه گیری: ساخت سویه مهندسی شده مولد epex در این مطالعه تایید شد. از این سویه ساخته شده می توان در تولید پروتئین نوترکیب epex جهت اهداف تشخیصی و درمانی استفاده کرد

Construction of recombinant yeast expressing EpEX as a suitable candidate in cancer diagnosis and therapy

Introduction: Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is a membrane glycoprotein that is overexpressed on the majority of tumor cells of epithelial origin and thereby can be used as a target of immunodetection and immunotherapy of cancer. So, it is important to produce this protein in its native form. Interestingly, during the last two decades, the yeast Pichia pastoris (P. pastoris) has become a popular host for the production of recombinant proteins because it combines the advantages of both mammalian and prokaryotic expression systems. In this study, the Pichia expressing EpCAM extracellular domain (EpEX) was constructed.Materials and Methods: The codon optimized gene encoding EpEX protein was cloned in the XhoI and XbaI restriction sites of the pPICZαB vector. The constructed plasmid was integrated into GS115 strain by electroporation. Positive clones were evaluated by PCR using AOX1 primers.Results: Sequencing as well as restriction enzyme analysis utilizing XhoI and XbaI (3506, 843 bp bands), as well as BamHI (3651, 698 bp bands) confirmed construction of recombinant EpEX pPICZαB. PCR based screening results of integrants showed two bands (2200 and 1345 bp), when AOX1 primer set was used.Conclusion: These findings imply that the engineered strain was constructed. The constructed strain can be used in EpEX recombinant protein production for diagnostic and therapeutic purposes.