بهینه‌سازی استخراج dna برای مطالعه طول تلومر از نمونه‌های خون منجمد

زمینه: بهینه‌سازی استخراج dna در راستای حفظ طول تلومر به‌عنوان زیست‌نشانگر پیری و انواع بیماری‌ها بسیار مهم است. نمونه‌های خونی که به‌طور طولانی مدت نگهداری شده‌اند، منبع بسیار مهمی برای مطالعات ژنتیکی محسوب می‌شوند. در این مطالعه با استفاده از بافرهای لیز مختلف به همراه بافر استخراج ctab، کیفیت dna استخراجی و اثر بازدارنده‌های همراه آن بر روی pcr کمی در مطالعات تلومر بررسی شد.مواد و روش‌ها: استخراج dna با 6 بافر لیزکننده گلبول قرمز و بافر استخراج بر پایه ctab، انجام شد. یکپارچگی dna با ژل الکتروفورز، کمّیت با جذب در 260 نانومتر و خلوص آن با مقادیر مورد انتظار 8/1 و 2/2-2 برای نسبت‌های 280a/260a و 230a/260a ارزیابی گردید. ارزیابی کمّی اثر هر بافر در واکنش q-pcr و تکرارپذیری نتایج به ترتیب با محاسبه بازده واکنش، ضریب تعیین (r2) و درصد ضریب تغییرات (%cv) محاسبه شد.یافته‌ها: بیش‌ترین مقدار dna استخراج شده (324/93 نانوگرم بر میلی‌لیتر، 11/53cv%:) با استفاده از بافر 5 (10 میلی‌مولار tris-hcl 6/7ph=، 50 میلی‌مولار nacl) به‌دست آمد. تمامی بافرها مقادیر مطلوب برای 280a/260a و 230a/260a داشتند و از نظر خلوص dna تفاوتی (0/05p>) نداشتند. طبق نتایج ژل، dna استخراج شده همه بافرها به جز یکی، فاقد خردشدگی بود. مولکول dna استخراج شده با بافر 1 (nh4cl 155میلی‌مولار، khco3 10 میلی‌مولار و edta 5 میلی‌مولار) بهترین عملکرد را در واکنش q-pcr برای ژن hbg (0/126=e و 0/97=r2) و تلومر (0/99= بازده، 0/99=r2) داشت.نتیجه‌گیری: مولکول dna استخراج شده با بافر 1 از نمونه خون منجمد جهت مطالعه تلومر کم‌ترین بازدارندگی q-pcr را نشان داد.

optimizing dna extraction from frozen blood samples for studying telomere length

background: optimizing dna extraction for the preservation of telomere length – as a biomarker for ageing and vari-ous diseases – is highly important. long-term stored blood samples are considered essential resources for genetic studies. in this study, different lysis buffers were used along with ctab extraction buffer to inves-tigate the quality of extracted dna and the effect of its accompanying inhibitors on quantitative pcr (q-pcr) in telomere studies.materials and methods: dna extraction was performed using six rbc lysis buffers and ctab-based extraction buffer. dna integrity was evaluated by gel electrophoresis, quantity by absorbance at 260 nm and its purity with expected values of 1.8 and 2-2.2 for the ratios of a260/a280 and a260/a230. the quantitative effect of each buffer in q-pcr and the repeatability of the results were assessed by calculating the reaction efficiency, coefficient of determination (r2), and percentage of coefficient of variation (%cv).results: buffer number 5 (10 mm tris-hcl, ph 7.6, 50 mm nacl) yielded the highest amount of dna extraction (324.93 ng/ml, %cv 11.53). all the extracted dna samples were pure, as indicated by the acceptable a260/a280 and a260/a230ratios (p>0.05). gel analysis revealed that the extracted dna of all the buffers ex-cept one was intact. the dna molecule extracted with buffer number 1 (155 mm nh4cl, 10 mm khco3, and 5 mm edta) showed the best performance in q-pcr for hbg gene (efficiency=0.126, r2=0.97) and telomere (efficiency=0.99, r2=0.99).conclusion: the dna molecule extracted from frozen blood samples by buffer number 1 showed the least q-pcr inhibition for telomere study.