سنتز این‌سیلیکو کنترل مثبت hsv-2 با استفاده از روش polymerase cycling assembly

سابقه و هدف استفاده از کنترل مثبت در آزمایش‌های real-time pcr برای اطمینان از صحت آزمایش ضروری است که این کنترل‌ها در حال حاضر عمدتاً از منابع بالینی تهیه می‌شوند. زمانی که دسترسی به نمونه‌های مثبت بیولوژیک فراهم نباشد استفاده از روش pca یا polymerase cycle assembly برای ساخت کنترل مثبت، راهگشا خواهد بود. هدف از این پژوهش تعیین کارآیی روش سنتز آنزیمی برای تولید قطعات dna ژنومیک جهت کاربردهای بیولوژی مولکولی بود. تاکنون مطالعه‌ای پیرامون بررسی کارآیی روش pca به منظور تولید کنترل مثبت hsv-2 انجام نگرفته است و این روش عمدتاً برای مونتاژ توالی استفاده شده است. مواد و روش‌هااولین قدم در این مطالعه تجربی، طراحی قطعات هم‌پوشان بود. ناحیه‌ای در ژنوم hsv-2 که برای آن این قطعات طراحی شدند، ناحیه‌ای منحصر به فرد به نام us6 بود. این ناحیه از طریق یک مطالعه گذشته‌نگر انتخاب شد. سپس ساختارهای ثانویه و پارامترهای ترمودینامیکی قطعات همپوشان با نرم‌افزار alleleld بررسی شد. با استفاده از نرم افزار mega نسخه 11، طراحی آغازگرها برای ناحیه ای منحصر به فرد در ژن us6 در ژنوم hsv-2 صورت گرفت. ژنوم hsv-2 با نرم افزار snapgene مورد بررسی قرار گرفت. بررسی تکمیلی خود آغازگرها و محصول آنها از ساحتار ثانویه با mfold صورت گرفت. این نرم‌افزار، توالی که قرار است برای آغازگر طراحی شود از نظر ساختار ثانویه بررسی می‌کند.یافته‌هابا توجه به درجه بالای شباهت توالی‌های hsv-1 و hsv-2 در بررسی‌های هم ردیفی، با سخت‌گیری شدید برای نواحی با بیشترین تفاوت طبیعی در محل ژن us6، آغازگر و قطعات هم‌پوشان طراحی شد. نتایج بلاست برای محصول pcr در محیط in silico و حصول بالاترین امتیاز برای hsv-2 اختصاصیت آغازگرهای طراحی شده را تایید کرد. توسط نرم‌افزار snapgene، اندازه قطعه تکثیر یافته در این مطالعه تخمین زده شد که برای مطالعه‌های بعدی 70 جفت باز باشد.  نتیجه گیری            نتایج حاصله نشان داد روش سنتتیک می‌تواند کیفیت مناسبی برای ساخت کنترل مثبت داشته باشد و در حقیقت در محیط in silico توالی‌های طراحی شده به عنوان کنترل مثبت hsv-2 از منظر محتوای توالی مشابه با توالی‌های طبیعی این ویروس بودند که این مهم نشان می‌دهد نتایج روش pca معادل کاربرد کنترل بالینی مثبت است. 

in silico synthesis of hsv-2 positive control using polymerase cycling assembly

a b s t r a c tbackground and objectivesthe use of positive controls in real-time pcr experiments is crucial for ensuring assay accuracy and reliability. traditionally, such controls are derived from clinical resources. however, in situations where access to biological samples is limited, polymerase cycle assembly (pca) provides a reliable alternative for creating positive controls. the aim of this study was to evaluate the efficiency of the enzymatic method for producing genomic dna fragments suitable for molecular biology applications. to the best of our knowledge, while pca has been primarily employed for assembling sequences, its utility in constructing hsv-2 positive controls has not yet been investigated. materials and methodsin this experimental study, the first step involved designing overlapping dna fragments targeting the us6 region of the hsv-2 genome, a unique and well-characterized sequence selected as a suitable target. the selection of the us6 region was based on a literature review analysis. the overlapping fragments were evaluated for secondary structures and thermodynamic parameters using alleleid software. primer design for the us6 region was performed using mega version 11, ensuring specificity to the hsv-2 genome. the evaluation of the genome hsv-2 with the snapgene software has been carried out. a comprehensive examination of the primers and their products from the secondary structure was conducted using mfold. this software analyses the sequence intended for primer design in terms of its secondary structure.resultsalignment analysis revealed a high degree of sequence similarity between hsv-1 and hsv-2. therefore, primers and overlapping fragments were designed to target a region exhibiting the greatest natural variation. the results demonstrated that the in silico positive controls were comparable to natural controls, and the specificity of designed primers was confirmed.  using snapgene software, the size of reproduced dna segment was estimated to be approximately 70 base pairs, providing a suitable template for future studies.conclusions  the results demonstrate that pca is an effective and highly reliable method for synthesizing positive controls for molecular diagnostics. targeting the hsv-2 us6 region ensured specificity and structural integrity of the synthetic fragment.