راه اندازی روشreal time pcr taqman جهت تعیین میزان بار پرووایرال ویروس htlv-1 با استفاده از ژن hbz

سابقه و هدف ویروس htlv-1 اولین رتروویروس انکوژن انسانی است که با بیماری‌های atl و ham/tsp مرتبط می‌باشد. ژن hbz به‌عنوان یکی از ژن‌های کلیدی این ویروس، به دلیل ایمنی‌زایی پایین و پایداری ژنتیکی، نقش مهمی در پیشرفت بیماری ایفا می‌کند. با وجود پیشرفت روش‌های تشخیصی مانند الایزا و وسترن بلات، در برخی موارد نتایج نامشخص گزارش می‌شود. از سوی دیگر، اندازه‌گیری بار ویروسی در پیش‌آگهی بیماری اهمیت دارد. در این مطالعه، با استفاده از روش taqman real time pcr، سیستمی حساس برای تعیین پرووایرال لود htlv-1 بر اساس ژن hbz طراحی و راه‌اندازی شد.مواد و روش‌هادر این مطالعه تجربی، آغازگرها و پروب برای ناحیه ای از ژن hbz به طولbp  106 طراحی گردید. سپس dna ژنومی از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی یا pbmcs استخراج شد. پس از تکثیر ژن hbz ، محصول pcr در پلاسمیدtopo ta vector  کلون گردید و از آن به عنوان استاندارد جهت راه‌اندازی روش taqman real time pcr استفاده شد. یافته‌هابرای رسم منحنی استاندارد، از پلاسمید نوترکیب رقت‌های لگاریتمی 108-101× 1/2 تهیه گردید. در این آزمایش، شیب خط منحنی استاندارد برابر با 3/2- وr2  برابر با 0.97 بود که نشان‌دهنده خطی بودن و کارآیی آزمایش می‌باشد. نتایج تکرارپذیری واکنش در سطح درون‌سنجی و بین سنجی (در قالب سه تکرار در هر مرحله کاری) و میانگین ضریب تغییرات cv برای نمونه‌های استاندارد، به ترتیب کمتر از 5/3 % و 5/9 % بود. هم‌چنین کمترین حد تشخیص این آزمایش برابر با copies/µl 1/2× 101 بوده که نشان‌دهنده حساسیت بالای این روش می‌باشد.نتیجه گیری            استفاده از روش real time pcr taqman با توجه به حساسیت بالا، آنالیز و کاربرد آسان می تواند روش مناسبی برای تعیین بار پرووایرال ویروس htlv-1 باشد و امکان پیش‌آگهی دقیق‌تری از بروز بیماری‌ها به واسطه این ویروس را فراهم کند.

development of a taqman real time pcr assay for quantifying the htlv-1 proviral load using the hbz gene

a b s t r a c tbackground and objectiveshtlv-1 is the first identified human oncogenic retrovirus, associated with atl and ham/tsp diseases. the hbz gene, one of the key genes of this virus, plays an important role in disease progression due to its low immunogenicity and genetic stability. despite the progress of diagnostic methods such as elisa and western blot, indeterminate results are occasionally reported. moreover, measuring viral load is critical for prognosis of the disease. in this study, a sensitive system for determining htlv-1 proviral load based on the hbz gene was designed and implemented using the taqman real time pcr method.materials and methodsin this experimental study, primers and probes were designed to amplify a 106 bp region of the hbz gene. then, genomic dna was extracted from pbmcs. after amplification of the hbz gene, the pcr product was inserted into the topo ta vector and used as a standard to develop the taqman real time pcr method.resultsthe logarithmic dilutions of 1.2×101-108 were prepared from the recombinant plasmid to draw the standard curve. the slope of the standard curve line was -3.2 and r2 was 0.97, indicating the linearity and efficiency of the test. the results of the reproducibility of the reaction at the intra-assay and inter-assay levels (three replicates per step) and the average coefficient of variation cv of the standard samples were below 5.3% and 5.9%, respectively. also, the limit of detection of this test was determined to be 1.2×101 copies/µl, reflecting the high sensitivity of this assay.conclusions  given its high sensitivity, rapid analysis and ease of use, the real time pcr method represents a suitable approach for determining the proviral load of htlv-1 and assessing the prognosis of associated diseases.