کلونینگ آنزیم آلفا گالاکتوزیداز با هدف تبدیل آنتی‌ژن b گروه خونی به آنتی‌ژن o

سابقه و هدف کمبود گروه‎های خونی سیستم abo یکی از مشکلات متداول مراکز انتقال خون در دنیا می‎باشد. هم‌ ز‌مان با پیشرفت علم مهندسی ژنتیک و تخلیص پروتئین‎ها، تبدیل آنتی‎ژن‎های a و b به آنتی‎ژن o و ایجاد گروه خونی واحد مطرح شد. هدف از این پژوهش، بیان ژن آلفا گالاکتوزیداز در میزبان پروکاریوتی e.coli با ایجاد تغییرات پس از ترجمه و در نهایت تبدیل آنتی‎ژن b گروه خونی به آنتی‎ژن o بود.مواد و روش‌هادر این مطالعه تجربی، ژن آلفا گالاکتوزیداز دانه قهوه که پس از بهینه‎سازی کدون‎ها در پلاسمید pbha حاوی جایگاه برش آنزیم‎های bamh1 و nco1 کلون شده بود، در باکتری e.coli سویه top10 تکثیر و استخراج شد. ژن آلفا گالاکتوزیداز پس از برش با آنزیم‌های فوق و تخلیص روی ژل آگاروز مجدداً در پلاسمید بیانی pet-20b کلون شده و به باکتری e.coli سویه rosetta 2 (de3) وارد شد. بیان ژن با استفاده از القاکننده iptg انجام شد. وجود پروتئین تولیدی با استفاده از sds-page و وسترن بلات بررسی شد. آزمون عملکرد پروتئین نیز با توانایی تبدیل گلبول‎های b به o ارزیابی شد. یافته‌هاوسترن بلات و sds-page وجود پروتئین در پری پلاسم باکتری را تائید کرد. آنزیم تخلیص شده توانست آنتی‎ژن b را به طور نسبی از گلبول قرمز حذف کرده و میزان آگلوتیناسیون با آنتی‎سرم b را به میزان زیادی کاهش دهد. نتیجه گیریبیان پروتئین یوکاریوتی در میزبان پروکاریوتی می‎تواند در تولید انبوه آنزیم گالاکتوزیداز برای کاربرد در مراکز انتقال خون کارگشا باشد. بهینه‌سازی شرایط مختلف بیان برای دستیابی به مقادیر کافی از آنزیم ضروری می‎باشد. 

Cloning and expression a-galactosidase in order to convert B to O blood group

AbstractBackground and ObjectivesThe shortage of different ABO blood groups is a permanent problem that many blood transfusion centers encounter. The conversion of blood group A and B to group O is a solution to this problem. In this research we aimed to clone and express the α-galactosidase enzyme gene to convert the blood group B to O.Materials and MethodsIn this experimental study, the α-galacosidase gene from coffee bean was codon-optimized and cloned into the pBHA plasmid. After replication in E. coli, plasmid was cut with BamH1 and Nco1 restriction enzymes and the α-galacosidase gene was purified by gel electrophoresis. The gene was then cloned into the expression vector, pET-20b. The expression construct was introduced into E. coli Rosetta 2 (DE3) and the expression of the enzyme was induced by IPTG. The presence of protein production was investigated using SDS-PAGE and Western blotting. Protein function test was also evaluated by the ability of B cells to convert to O cells.ResultsThe presence of the recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot assay. The purified protein could partially convert blood group B RBCs into group O as detected by decreasing the agglutination strength with B antiserum from 4+ to less than 1+.Conclusions  The production of eukaryotic proteins in a prokaryotic host is a major step in mass production. Optimization of different expression conditions is essential to achieve sufficient amount of enzyme.