راه‌اندازی روش real-time pcr جهت تعیین بار پرووایرال ویروس لنفوتروپیک t انسانی نوع i به روش سایبرگرین جهت نمونه‌های اهداکنندگان خون

سابقه و هدف استان خراسان در ایران برای ویروسhtlv1 اندمیک است. با توجه به ناکارآمد بودن آزمایش های سرولوژیکی در شناسایی ویروس ها در دوره کمون، تایید جواب های نامشخص وسترن بلات و خطر انتقال ویروس htlv1 از راه خون و فرآورده های خونی، آزمایش real - time pcr به روش سایبرگرین راه اندازی شد. نمونه های مورد آزمایش، مربوط به اهداکنندگان خون آلوده به این ویروس در پایگاه انتقال خون استان خراسان رضوی در سال 1396 بودند.مواد و روش هادر یک مطالعه تجربی، با استفاده از روش کلونینگ و رسم منحنی استاندارد، آزمایش real time pcr برای تعیین پرووایرال لود راه اندازی شد. ابتدا dnaژنومی از سلول های تک هسته ای خون محیطی استخراج شد. سپس محصول pcr ژن tax ، در یک وکتور کلونینگ قرار داده شد و با رقت سازی، منحنی استاندارد رسم و آزمایش real - time pcr با روش سایبرگرین راه اندازی شد.یافته هابا استفاده از محصول pcr برای ژن tax، وکتور ptz57/t و باکتریe.coli (سوش tg1) کلونینگ انجام شد. صحت کلونینگ با colony pcr و تعیین سکانس تایید شد. محصول کلونینگ به عنوان استاندارد آزمایش real -time pcr استفاده شد و با رقت سازی، منحنی استاندارد رسم شد. شیب خط منحنی استاندارد 3.3= slope و 0.99 = 2r بوده که نشان دهنده خطی بودن و کارآیی واکنش آزمایش می باشد. نتیجه گیریروش real -time pcr جهت تعیین پرووایرال لود ویروس htlv1 مناسب است.

Design a Real Time PCR with SYBR Green for quantification of HTLV-1 proviral load for blood donors

AbstractBackground and ObjectivesIn Iran, Khorasan province is an endemic area for HTLV1 virus. Considering the inability of serological tests to determine HTLV1 in window period, their failure to confirm the indetermination results of western blot, and given the probability for HTLV1 transfusion transmission, a SYBR greenbased Real Time PCR was set to measure the HTLV1 proviral load. Materials and MethodsIn this experimental study, using a cloning method and drawing a standard curve, the Real Time PCR test was run to determine the HTLV1 proviral load. At first, genomic DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells. Then, the PCR product of the Tax gene was placed in a cloning vector and recombinant plasmid was diluted by drawing a standard curve and a realtime PCR test was conducted using SYBR Green method. ResultsCloning was performed using PCR product for tax gene, pTZ57/T vector, and E. coli (TG1 strain). Cloning accuracy was confirmed with Colony PCR and sequencing and used as the RealTime PCR test standard. The standard curve was drawn with serial dilutions of recombinant plasmid containing Tax1 gene. The slope of the standard curve was 3.3 and R2 = 0.99 which indicates the linearity and efficiency of the test reaction. Conclusions Real Time PCR method is an appropriate method to measure HTLV1 proviral load.