تولید رده سلولی k562 بیان کننده اندونوکلئاز cas9 (crispr-associated9)

چکیدهسابقه و هدف امروزه ژنوم رده های سلولی به منظور ایجاد مدل های بیماری و درمان آن ها ویرایش می شود. البته بزرگی ژن cas9 موجب مشکلاتی از جمله پایین بودن کارآیی سیستم crispr شده است. برای حل این مشکل، رده های سلولی بیان کننده cas9 تولید شده اند که در آن ها تنها باید بخش rna راهنمای crispr به سلول ترانسفکت شود.مواد و روش هادر این مطالعه تجربی، قطعه pgkpuro/cmv (ppc) با pcr از وکتور paavs1purodnr تکثیر شده و در وکتور ptg19tهمسانه سازی شد. سپس قطعه ppc از این وکتور با آنزیم های kpni و ecori خارج شد. وکتور pcasguideaavs1 نیز تحت برش آنزیمی مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه ppc منجر به ساخت وکتور pppccas گردید. پس از بهینه کردن شرایط الکتروپوریشن، وکتور pppccas به درون سلول های k562 الکتروپوریت شد و سلول های مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند و میزان بیان cas9 در آن ها با realtime pcr بررسی شد.یافته هابا pcr قطعه ای به طول 2514 جفت باز تکثیر شد. وکتورpppccas طی دو مرحله همسانه سازی ساخته شد. سلول های ترانسفکت شده مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند. انتخاب کلونی در ادامه انجام شد و سه کلونی که نسبت به هم بیان های بالا، متوسط و پایین داشتند، انتخاب شدند.نتیجه گیریدر این مطالعه سلول های k562 بیان کننده cas9 به دست آمدند که از آن ها می توان در مطالعه های آتی ژنومیک عملکردی و نیز تولید مدل های سلولی بیماری های انسانی استفاده کرد.

Generation of K562 cell line expressing Cas9 endonuclease (CRISPR-associated9)

AbstractBackground and ObjectivesThe genome of cell lines is nowadays edited to create disease models and treat them. Of course, the size of the cas9 gene has caused problems like the low efficiency of the CRISPR system. To solve this problem, Cas9 expressing cell lines have been generated in which CRISPR RNA should only be transfected to the cell. Materials and MethodsThis article is experimental. PGKPURO / CMV (PPC) fragment was amplified with PCR from pAAVS1puroDNR vector and cloned in pTG19T vector. The PPC fragment from this vector was removed by KpnI and EcoRI enzymes. Also the pCasGuideAAVS1 vector was subjected to the same enzymatic cutting and its attachment to the PPC fragment resulted in the production of the pPPCCas vector. After optimizing the electroporation conditions, the pPPCCas vector was electroporated into K562 cells and puromycin resistant cells were selected and Cas9 expression level was evaluated by Realtime PCR. ResultsA PCR fragment of 2514 bp was amplified. The vector pPPCCas was cloned in two steps. puromycin resistant transfected cells were selected. Clonal selection was carried out and three colonies with high, medium and low expression level of Cas9 were isolated. Conclusions The Cas9expressing K562 cells derived in this study can be applied both for functional genomic researches and design cellular models of human diseases in future.