بیان و تخلیص پروتئین کایمر نوترکیب دربردارنده ctxb و tcpa از ویبریوکلرا و بررسی تیتر آنتی‌بادی در موش

هدف: عامل کلونیزاسیون پیلی tcpaو توکسین کلرا مهم‌ترین عوامل بیماری‌زایی ویبریو کلرا هستند و توانایی تحریک سیستم ایمنی را دارند. هدف از این تحقیق بررسی بیوانفورماتیکی، بیان پروتئین کایمر نوترکیب ctxbtcpa در باکتری اشریشیا کلی و تولید آنتی‌بادی علیه آن در موش بود. مواد و روش‌ها: کاست ژنی دربردارنده ژن‌های ctxb، tcpaو فاصله‌انداز با روش‌ بیوانفورماتیکی طراحی شد. شاخصه‌هایی از قبیل ساختار پروتئین کایمر و اپی توپ‌ها بررسی شد. برای ساخت کاست ژنی، ژن‌های ctxbو tcpaتکثیر و در ناقل pet28a همسانه‌سازی شدند. بیان ژن‌های ctxbtcpaدر pet28a(+) تحت القای iptg انجام شد. پروتئین نوترکیب ctxbtcpa به روش sdspage و لکه‌گذاری وسترن تایید شد. تیتر آنتی‌بادی تولید شده در سرم موش با روش الایزا بررسی شد. نتایج: شاخص انطباق‌پذیری در ژن بهینه‌سازی شده به 9/0 تغییر کرد. با بهینه‌‌سازی ژنی درصد کدون‌های با ترجیح بالا به 74 درصد افزایش یافت. تحلیل آنزیمی همسانه‌سازی کایمر ژنی ctxbtcpa در ناقل بیانی pet28a(+) را تایید کرد. پروتئینی با وزن مولکولی 35 کیلو دالتون در sdspage دیده شد. واکنش پروتئین با آنتی‌بادی ضد سم کلرا در وسترن بلات تایید شد. میزان پروتئین خالص شده 1/33 میلی‌گرم در لیتر بود. ایمن‌سازی موش‌ها پاسخ آنتی‌بادی سرمی را القا کرد. نتیجه‌گیری:پروتئین کایمر می‌تواند برای بررسی‌های ایمنی علیه وبا در نظر گرفته شود.

Expression and purification of recombinant chimeric protein contains CtxB and TcpA from Vibrio cholera and investigation of antibody titer in mouse

Objective: The TcpA colonization factor of pili A and the cholera toxin are the most important pathogenesis factors of Vibrio cholera that have the ability to stimulate the immune system. The aim of this study is a bioinformatics analysis of the expression of CtxBTcpA recombinant chimeric protein in E. coli, and production of antibody against it in mice. Methods: We designed a gene cassette that contained the CtxB and TcpA genes, and a spacer linker by using bioinformatics. Characteristics that include the structure of the chimer protein and epitopes were studied. In order to build a gene cassette, TcpA and CtxB genes were proliferated and cloned in pET28a(+). CtxBTcpA gene expression was induced by IPTG. The produced CtxBTcpA recombinant protein was confirmed by SDSPAGE and Western blot analyses. Antibody produced from mice serum was isolated and confirmed by ELISA. Results: The codon adaptation index of the optimized gene was 0.9. The prevalence ratio codons increased to 74% through codon optimization. Enzyme analysis verified the chimeric gene CtxBTcpA cloning in the pET28a (+) expression vector. A protein with a molecular weight of 35 kDa was seen on SDSPAGE. Its reaction with antihistidine antibodies was confirmed by Western blot. The purified protein was 33.100 mg/l. Immunization of mice induced a serum antibody response. Conclusion: The chimeric protein can be considered a good candidate for effective immunity against cholera.