•تولید لنتی‏ویروس‏های نوترکیب بیان کننده miR-16 توسط ترانسفکشن موقت سلول‏های 293T

هدف: هدف از این مطالعه تولید لنتی‏ویروس‏های بیان کننده mir-16 است. پس از ترانسداکشن، تغییرات ایجاد شده در سطوح بیانی این mirna و پروتیین هدف آن ارزیابی خواهد شد.مواد و روش‏ها: قطعه ژنی حاوی توالی پیش‏ساز mir-16 در پلاسمید لنتی ویروسی کلون شد. سازه نوترکیب همراه با پلاسمید‏های کد کننده پروتیین‏های ساختاری و پوششی ویروس توسط کلسیم-فسفات به رده سلولی 293t ترانسفکت شد. سوپ سلولی جمع‏آوری و ذرات ویروسی توسط اولتراسانترفیوژ رسوب داده شد و تعیین تیتر ویروس توسط میکروسکوپ فلورسانت و روش فلوسایتومتری انجام یافت. تغییرات در سطوح بیانی mir-16 و پروتیین هدف آن به‏ترتیب توسط روش‏های real-time pcr و لکه‏گذاری وسترن ارزیابی شد.نتایج: تایید حضور ژن در پلاسمید و درستی توالی آن توسط کلونی-pcr، هضم آنزیمی کلون‏های مثبت و توالی‏یابی انجام شد. پس از ترانسفکشن همزمان سلول‏های 293t با پلاسمید لنتی-mir و پلاسمید‏های ساختاری و پوششی ویروس و تعیین تیتر ذرات ویروسی تغلیظ شده، سلول‏های مورد نظر با لنتی‏ویروس نوترکیب آلوده شدند. بیشینه بیان gfp در بیش از 80 درصد سلول‏های آلوده شده با لنتی‏ویروس در moi=1 حاصل شد. بررسی سطوح بیانی mir-16 توسط real-time pcr نشان داد که بیان این میکرو rna در سلول‏های آلوده شده با لنتی‏ویروس واجد mir-16 در مقایسه با گروه کنترل افزایش محسوسی دارد. تجزیه و تحلیل لکه‏گذاری وسترن نیز نشان داد بیش بیان mir-16 سبب کاهش بیان پروتیین bcl-2 می‏شود.نتیجه‏گیری: سیستم بیانی لنتی‏ویروسی ارایه شده می‏تواند به‏عنوان ابزاری در راستای تحویل‏رسانی موثر مقلدهای میکرو rna به سلول پیشنهاد شود.