بهینه‌سازی انجماد شیشه‌ای تخمک گوسفندی از طریق کاهش کلسیم با افزودن egta به محلول انجمادی

اهداف: در فرآیند انجماد شیشه‌ای، کلسیم داخل سلولی تحت تاثیر مواد محافظ انجماد افزایش و توانایی تکوین تخمک کاهش می‌یابد. مطالعه حاضر با هدف کاهش کلسیم محیط پایه انجماد به‌منظور بهبود میزان لقاح و توانایی تکوین تخمک انجام شد.مواد و روش‌ها: مجموعه تخمک و سلول‌های کومولوسی از تخمدان گوسفند جمع‌آوری و پس از 24 ساعت کشت در محیط بلوغ، تخمک‌های متافاز ii به پنج گروه شامل یک گروه کنترل (غیرانجمادی) و چهار گروه انجمادی تقسیم شدند. گروه‌های انجمادی براساس حضور یا عدم حضور اتیلن‌گلیکول‌تترااستیک‌اسید (egta) و کلسیم در محیط پایه طراحی شدند. به این منظور از چهار نوع محیط پایه شامل فسفات‌بافرسالین با و بدون کلسیم، همچنین فسفات‌بافرسالین دارای egta، با و بدون کلسیم استفاده شد. پس از ذوب، میزان لقاح و تکوین جنین تا تشکیل بلاستوسیست اندازه‌گیری شد. کیفیت بلاستوسیست با استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی و تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد.یافته‌ها: بین گروه‌های انجمادی از لحاظ میزان زنده‌مانی تفاوت معنی‌داری وجود نداشت. میزان لقاح در محیط فاقد کلسیم بالاتر از سایر گروه‌های انجمادی (0/55±68/81 و 0/67±67/77، به ترتیب در حضور و عدم حضور egta) بود. در محیط فاقد کلسیم و حاوی egta تکوین جنین 3 و 5روزه، به ترتیب 1/38 53/65± و 2/85±46/21 نسبت به سایر گروه‌های انجمادی بالاتر بود (p<0/05). شمارش سلولی بلاستوسیست تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های انجمادی و گروه کنترل نشان نداد.نتیجه گیری: استفاده از سیستم انجمادی بدون کلسیم از طریق افزودن egta می‌تواند سبب بهبود کیفیت تخمک بالغ گوسفندی پس از انجماد و بهبود تکوین جنین‌های حاصل شود.

Optimization of Ovine-Oocyte Vitrification Utilizing Calcium Depletion by Adding EGTA to Freezing Solution

Aims: Vitrification affects intracellular calcium, fertilization ability, and developmental competence of mammalian oocytes. This effect may be more closely associated with an intracellular calcium rise induced by cryoprotectants. The present study aimed to assess whether reducing calcium of vitrification solution could improve the fertilization and developmental competence of ovine oocytes.Materials Methods: COCs were collected from the ovine ovary. MII oocytes were divided into 5 groups, one nonvitrified (control) and four vitrified groups 24 hours after COC culture. Vitrified groups were designed according to the presence or absence of EGTA (a calcium chelator) and/or calcium in base media, including mPB1+ (modified PBS with Ca2+), mPB1 (modified PBS without Ca2+), mPB1+/EGTA (mPB1+ containing EGTA), mPB1/EGTA (mPB1 containing EGTA). Fertilization rate and in vitro development were evaluated after embryo thawing. Also, blastocyst quality was assessed using differential staining. Data analysis was carried out using oneway analysis variance.Findings: There was no significant difference in the viability rate between vitrified groups. Fertilization and the developmental rate decreased in the presence of calcium (p<0.05) but in the calciumfree medium with the EGTA supplementation group, the developmental rate obviously increased. On the other hand, blastocyst cell count in the control group was similar to vitrified groups.Conclusion: Using a calciumfree cryoprotectant by adding EGTA can improve the quality of vitrifiedthawed ovine MII oocyte and also a higher developmental rate in obtained embryos.