سنجش لوسیفراز روشی برای نشان‌دادن صلاحیت میکروrna let-7bانتخابی در سرکوب تکثیر ویروس هپاتیت c

اهداف: توسعه عوامل ضدویروسی جدید رویکردی مناسب برای ریشه‌کن‌شدن عفونت هپاتیت c است. به‌دلیل عدم وجود مدل‌های حیوانی مناسب همواره سدی برای ارزیابی مناسب ترکیبات ضدویروسی در محیط زنده وجود دارد. توجه روزافزون به micrornaها نقطه قوت جدیدی در درمان‌های ضدویروسی محسوب می‌شود. هدف از مطالعه حاضر، استفاده از سنجش لوسیفراز برای تایید میان‌کنش بین mirna و rna ژنومی ویروس هپاتیت c (hcv) ژنوتیپ 1b به‌منظور سرکوب تکثیر این ویروس است.مواد و روش‌ها: قطعات ژنومی ns5b از ژنوم ویروس هپاتیت c به‌عنوان ناحیه mre درون وکتور psicheck2tm ساب‌کلون شد. بیان نسبی وکتورهای لنتی‌ویروس بیان‌کننده mirna در سلول huh7.5 از طریق میکروسکوپ فلورسانس و realtime pcr ارزیابی شد. لنتی‌ویروس بیان‌کننده let7b به سلول‌های huh7.5 ترانسداکت شد. ns5bpsicheck2tm (mre) به سلول huh7.5 مورد نظر ترانسفکت شد. به کمک کیت سنجش دوگانه لوسیفراز بیان نسبی لوسیفراز اندازه‌گیری شد.یافته‌ها: با استفاده از لنتی‌ویروس‌های بیان‌کننده let7b شرایط بیان بالا و دایمی از let7b در سلول مورد نظر ایجاد شد. از سوی دیگر اتصال اختصاصی توالی پاسخ دهنده (ns5b) به میکروrna let7b با کاهش نور لوسیفراز نشان داده شد.نتیجه‌گیری: برای حفظ بیان بالا و پایدار میکروrnaها در سلول از وکتورهای لنتی‌ویروس استفاده می‌شود. استفاده از سنجش لوسیفراز یکی از مناسب‌ترین روش‌های تایید میان‌کنش بین mirnamrna است که می‌تواند برای ژن‌های ویروسی دیگر با میکروrnaهای متفاوت استفاده شود.

Luciferase Assay for Demonstrate the Competence of Selective MicroRNA of let-7b in Suppressing HCV Replication

Aims: The development of new antiviral agents is an appropriate approach to eradicate hepatitis C infection. Due to the lack of suitable animal models, there is always a barrier to the proper evaluation of antiviral compounds in vivo. The growing attention to microRNAs is a new strength in antiviral therapy. The aim of the present study was to use luciferase assay to confirm the specific interaction between miRNA and genomic RNA of hepatitis C virus (HCV) genotype 1b to suppress the replication of the virus.Materials Methods: The NS5B genomic fragments of the HCV genome were subcloned into the psiCHECK2TM vector as MRE. The relative expression of lentivirus vectors expressing miRNAs in Huh7.5 cells was assessed through fluorescence microscopy and realtime PCR. The lentivirus expressing let7b was transduced to Huh7.5 cells. The NS5BpsiCHECK2TM (MRE) was transfected to the Huh7.5 cell. The relative expression of luciferase was measured using a luciferase dual assay kit.Findings: With the use of lentiviruses expressing let7b, high and permanent expression of let7b was created in the target cell. On the other hand, the specific attachment of the responsive sequence (NS5B) to the microRNA of let7b was shown by decreasing luciferase light.Conclusion: Lentiviral vectors are used to maintain high and stable expression of microRNAs in cells. The use of luciferase assay is one of the most appropriate methods to confirm the interaction between miRNAmRNA that can be used for other viral genes with different microRNAs.