کلونینگ و بیان ژن اینترلوکین15 در باکتری e. coli سویه rosetta (de3)

اینترلوکین15 (il-15)، سایتوکاینی است که به واسطه فعالیت‌های فیزیولوژیکی آن می‌تواند در درمان‌های ضدسرطان نقش ایفا کند. il-15 باعث تمایز، تکثیر، فعال‌شدن و بقای سلول‌های کشنده طبیعی می‌شود و بقای لنفوسیت‌های t خاطره‌ای را بهبود می‌بخشد. از آنجایی که راندمان تولید و تخلیص این سایتوکاین عمدتاً پایین است، علی‌رغم پیشرفت‌های اخیر، همچنان بهینه‌کردن شرایط تولید، ارزشمند است. بنابراین در مطالعه حاضر، اقدام به کلون و بیان ژن il-15 انسانی در باکتری متفاوت با سویه‌های قبلی شد و به جای بیان در باکتری e. coli سویه رایج bl21، از سویه rosetta (de3) استفاده شد که قادر است با استفاده از کدون‌های نادری که در باکتری کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرند، بیان ژن‌های یوکاریوتی را بهتر از سویه‌های دیگر انجام دهد، به‌طوری که پروتئین بیان‌شده شباهت بیشتری به پروتئین انسانی داشته باشد. پس از سنتز ژن il-15، توالی مورد نظر در وکتور بیانی باکتریال pet28a کلون شد و پس از تایید با کلنیpcr، هضم آنزیمی با آنزیم‌های bamhi و xhoi و مشاهده باند 391 بازی روی ژل آگارز و تعیین توالی، در باکتری e. coli سویه rosetta (de) ترانسفورم شد. القای بیان در جذب نوری 0/6 در od600 و در حضور 1میلی‌مولار ایزوپروپیل بتا دی تیوگالاکتوپیرانوزید (iptg) انجام شد. مشاهده باند 15کیلودالتونی روی ژل sdspage و سپس انجام وسترن‌بلات به کمک آنتی‌بادی اختصاصی تجاری علیه il-15، نشان از درستی فرآیند بیان داشت. راندمان بیان به کمک دانسیتومتری با نرم‌افزار fiji حدود 37% تخمین زده شد. با توجه به اینکه بیان ژن انسانی il-15 در سویه باکتریایی e. coli rosetta (de3) انجام شده است، انتظار می‌رود که در مطالعات بعدی، عملکرد مناسبی از خود نشان دهد.

Cloning and Expression of IL-15 Gene in E. coli, Rosetta (DE3) Strain

Interleukin 15 (IL15) is a cytokine that, due to its physiological activity, can play a role in anticancer therapies. It shows positive effect on Natural Killer cells differentiation, proliferation, activation, and surveillance and also on surveillance of memory CD8+ T cells. However, the expression and purification yield of recombinant IL15 is low. So, it worth improving the production conditions of this useful protein. Therefore in the present study, cloning and expression of human IL15 are reported in E. coli, strain Rosetta (DE3) which is different from previous bacterial hosts BL21 strain. This strain (Rosetta DE3) has the potential to use codons rarely used by bacteria and consequently, the expressed protein can be more similar to the human protein. First, the human IL15 coding sequence was synthetized, and then the sequence was cloned into pET28a plasmid. Confirming the accuracy of the final construct was done by colony PCR, restriction analysis (which was done using BamHI and XhoI restriction enzymes and the expected 391bp band was observed) and sequencing. Then, the recombinant construct was transformed into competent E. coli Rosetta (DE3) bacteria. Expression was done in OD600 of 0.6 in the presence of 1mM Isopropyl szlig;D1thiogalactopyranoside (IPTG). Protein characterization was done by SDSPAGE and then by western blotting using a specific commercial antiIL15 antibody. The 15kDa band on the gel and blot, showed the presence of IL15. Densitometry by Fiji software determined 37% production yield. It is expected a suitable function from this produced recombinant cytokine due to expression in E. coli Rosetta (DE3) in future studies.