بررسی مقاومت استرپتوکیناز کایمری حاصل از جابه‌جایی دومین‌ها میان دو گروه استرپتوکوکی نسبت به آلفا دو آنتی‌پلاسمین

اهداف: استرپتوکیناز کایمر حاصل از تبادل دومین استرپتوکیناز میان دو سویه استرپتوکوک بتاهمولیتیک گروه g و a به منظور بررسی اثر دومین های استرپتوکیناز در مقاومت به مهارکننده آلفا دو آنتی پلاسمین ساخته شد.مواد و روش ها: در مطالعه تجربی حاضر ژن های استرپتوکیناز (skg/ska) تکثیرشده از ژنوم دو سویه گروه a و g به ترتیب sk2balab49 و sk2ag88 در pet26b کلون شدند. به منظور تبادل دومین، محصول pcr حاوی دو مین بتا و گامای skalab49 در pet26skg88 فاقد این دومین ها قرار گرفت. پس از تایید هر سه سازه با آنالیز آنزیمی و توالی یابی، بیان در e.coli rosetta انجام و پروتئین ها با کروماتوگرافی تمایلی ninta تخلیص شدند. پس از تعیین غلظت، آنالیز با روش الکتروفورز ژل آکریلامید و وسترن بلات انجام شد. مقاومت به آلفا دو آنتی پلاسمین به روش رنگ سنجی با به کارگیری سوبسترای کروموژنیک s2251 اندازه گیری شد.یافته ها: نتایج الکتروفورز ژل آکریلامید و وسترن بلات نشان دهنده بیان پروتئین ها با اندازه 47کیلودالتون بود. در بالاترین غلظت آلفا دو آنتی پلاسمین، sk2ag88، 80% فعالیت در حالی که sk2balab49 و ( α2ag88 beta;2balab &2balab) skch، 55% فعالیت اولیه خود را نشان دادند.نتیجه گیری: skch الگوی کاهش فعالیت مشابه sk2balab49 را نشان می دهد که بیانگر نقش کمتر دومین آلفا نسبت به سایر دومین ها در بروز مقاومت به مهارکننده آلفا دو آنتی پلاسمین است.

Evaluation of the α2-Antipalsmin-Resistance of a Domain Exchanged-Chimeric Streptokinase from Two Streptococci Groups

Aims: The chimeric domainexchanged streptokinase (SKch) between two sk genes from groups G and A streptococci (SK2aG88 and SK2bALAB49, respectively) was constructed to evaluate the role of SKdomains ( α, beta;, &) in α2antipalsminresistance variations of SK.Materials and Methods: In this experimental study, PCRamplified genes of streptococci (skg, ska) were cloned into pET26b vector to produce pET26SKG88 and pET26SKALAB49. For domain exchange, the amplicon containing beta; and g domains of SK2bALAB49 was replaced for that of the SK2aG88 within pETSK2aG88 (pET26SKch; α2aG88 beta;2bALAB &2bALAB). All constructs were confirmed by restriction analyses/agarosegel electrophoresis and DNA sequencing, transformed into E.coli Rosetta, and induced by IPTG for protein expression. Proteins were purified by NiNTA chromatography, quantified by Bradford method, and analyzed by SDSPAGE/Western blotting assays. The α2antipalsminresistance was measured by S2251 colorimetric assay for plasminogen activation.Findings: SDSPAGE and western blotting results indicated the expression of proteins with the size of 47kD. At the highest concentration of α2antiplasmin, SK2aG88 remained 80% active, whereas the SK2bALAB49 and SKch retained 55% of their activity.Conclusion: SKch shows similar activity reduction, indicating the minor role of the α domain compared to beta; and g domains for α2antipalsminresistance.