همسانه‌سازی، بیان و خالص‌سازی اورات‌اکسیداز نوترکیب با استفاده از توالی اینتئین و پروتئین شبه الاستین

اهداف: بیان و خالص سازی اورات اکسیداز نوترکیب همانند سایر پروتئین های دارویی مستلزم صرف هزینه های زیادی است. استفاده از روش های غیرکروماتوگرافی در فرآیند خالص سازی می تواند سبب کاهش هزینه های تولید شود. بنابراین، هدف پژوهش حاضر، همسانه سازی، بیان و خالص سازی اورات اکسیداز نوترکیب با استفاده از توالی اینتئین و پروتئین شبه الاستین بود.مواد و روش ها: در پژوهش تجربی حاضر، ژن صناعی اورات اکسیداز در پایین دست توالی اینتئین و پروتئین شبه الاستین در پلاسمید بیانی قرار داده شد. بعد از کشت باکتری حاوی پلاسمید بیان کننده اورات اکسیداز، سلول ها لیز و محتوی پروتئین محلول از غیرمحلول به وسیله سانتریفوژ جدا شد. با افزودن نمک به بخش محلول حاوی اورات اکسیداز و در دمای c °37، آنزیم مورد نظر رسوب داده شد. با انحلال رسوب در بافر خاص برش و به واسطه حضور توالی اینتئین، اورات اکسیداز تولیدشده از پروتئین شبه الاستین جدا شد. با افزودن مجدد نمک در دمای c°37 پروتئین شبه الاستین رسوب و اورات اکسیداز در محلول باقی ماند. پس از بیان و خالص سازی اورات اکسیداز، میزان خلوص و فعالیت زیستی آن مورد ارزیابی قرار گرفت و با داروی استاندارد مقایسه شد.یافته ها: آنزیم اورات اکسیداز نوترکیب به صورت فیوژن با توالی کدکننده اینتئین و پروتئین شبه الاستین بیان و خالص شد. میزان خلوص 90% در این روش حاصل شد که معادل 1/89میلی گرم در میلی لیتر پروتئین بود. میزان مذکور معادل 1/64میلی گرم براساس فعالیت آنزیمی بود.نتیجه گیری: استفاده از توالی اینتئین و پروتئین شبه الاستین به صورت همراه با آنزیم اورات اکسیداز به بیان و خالص سازی این آنزیم بدون نیاز به روش کرماتوگرافی کمک می کند.

Cloning, Expression, and Purification of Recombinant Urate Oxidase Using Intein Sequence and Elastin-like Protein

Aims: Expression and purification of recombinant Urate oxidase as well as other pharmaceutical proteins are a costly process. The use of nonchromatographic methods in the purification process can reduce production costs. So, the aim of this study was cloning, expression, and purification of recombinant urate oxidase, using intein sequence and elastinlike protein (ELP).Materials and Methods: In the present experimental research, the synthetic urate oxidase gene was cloned in downstream of ELP ndash;Intein in an expression plasmid. After cultivating bacteria containing urate oxidase expression plasmid, the soluble fraction of cell lysate was separated from insoluble portion, using centrifugation. The recombinant urate oxidase was precipitated by adding salt and incubation at 37 deg;C. The resulting precipitant was resuspended in cleavage buffer and the urate oxidase was separated from ELP through Intein moiety. Adding salt for the second time and incubation at 37 deg;C resulted in separation of urate oxidase from fusion partner. After expressing and purifying the urate oxidase, purity and biological activity of recombinant urate oxidase were compared to standard drug.Findings: The recombinant urate oxidase was expressed and purified using ELP and Intein tags as fusions partners. The rescombinant enzyme showed a purity of %90 equal to 1.89 mg.ml1 based on protein concentration and 1.64 mg.ml1 based on activity. Conclusion: Using Intein sequence and Elastinlike protein, together with the Urate Oxidase enzyme helps to express and purify the enzyme without need for a chromatographic method.