بهینه‌سازی بیان سم شقایق دریایی (فراگاسیاتوکسین c) در باکتری e.coli سویه bl21

سابقه و هدف: شقایق دریایی از جنس اکتینیا در مناطق جزری سواحل صخره ای شمال اسپانیا بسیار متداول است. اکتینیا فراگاسیا یکی از گونه های مهم است که پروتئین سمی فراگاسیاتوکسین c را جهت دفاع و شکار ترشح می کند. هدف اصلی از این مطالعه، انتقال پلاسمید حاوی ژن کدکننده فراگاسیاتوکسین c به اشیرشیاکلی سویه bl21، بیان و یافتن شرایط مطلوب بیان می باشد.مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی برای انتقال شیمیایی، باکتری ها جهت جذب پلاسمید حاوی ژن frac به وسیله کلسیم کلراید سرد شسته و جهت اطمینان از انتقال پلاسمیدها، باکتری ها روی محیط حاوی آنتی بیوتیک مناسب (آمپی سیلین) کشت داده شدند. برای اطمینان بیش تر، استخراج پلاسمیدها در حجم کم با استفاده از کیت استخراج پلاسمید gf1 صورت گرفت. سپس تحت برش آنزیم های ncoi وhind ііі و هم چنین کنترل pcr قرار گرفتند. بعد از تایید حضور پلاسمید حاوی ژن frac در باکتری میزبان، باکتری ها جهت یافتن شرایط مطلوب بیان پروتئین frac توسط iptg 1mm در زمان های مختلف و دمای c ordm;20 القا شدند. پس از جمع آوری باکتری های بیان کننده frac در زمان های مختلف، بیان آن ها روی ژل سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید(sdspage) مشهود بود.یافته ها: نتایج ما نشان داد که پلاسمید حاوی ژن frac با موفقیت انتقال یافت. هم چنین نتایج sdspage نشان داد که frac در زمان های 6 و 8 ساعت با استفاده از iptg 1mm در دمای c °20 بیش ترین بیان را دارند.استنتاج: با توجه به نتایج، هر دو مرحله انتقال شیمیایی تاثیر قابل توجهی در کارایی انتقال دارند. رعایت اصول و دمای مطلوب می تواند ما را دریافتن شرایط مطلوب برای بیان هر پروتئین خاص در باکتری ها یاری کند.

Optimization of Sea Anemone Toxin (fragaceatoxin C) Expression in E.coli BL21

Background and purpose: Sea anemones of the genus Actinia are commonly found in the intertidal zone of the northern rocky coast of Spain. Actinia fragacea is one of the most important species that secretes a toxic protein, fragaceatoxin C (FraC), for defense and hunting purposes. The aim of this study was transformation of plasmid containing the gene encoding the FraC to Escherichia coli bacterial strain BL21, and identifying optimum expression condition.Materials and methods: In this experimental study, chemical transformation was conducted by washing the bacteria with cold calcium chloride to take up the plasmid containing the FraC gene. To ensure the transformation of plasmids, bacteria were grown on a medium containing an appropriate antibiotic (ampicilin). For greater certainty, the minipreparation of transformed plasmids was done using GF1 plasmid extraction Kit. The plasmids were then went under digestion check using NcoІ and Hind ІІІ enzymes and PCR check. After confirming the presence of a plasmid containing FraC in the host bacteria, the bacteria were induced by 1mM IPTG in different times at 20 ordm;C to find the optimum expression conditions. After collecting bacteria expressing FraC at different times, its expression was visualized on Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel (SDSPAGE).Results: Our results showed that the plasmid containing the FraC was successfully transformed. Also SDSPAGE results indicated that the FraC was successfully expressed at times of 6 and 8 h using 1mM IPTG at 20 ordm;C.Conclusion: According to the results, both steps of chemical transformation had significantly influenced the transformation efficiency. Following the principles and selecting optimum temperature could help us in finding the optimum conditions for expression of each specific protein in bacteria.