بررسی بیان ژن‌های دخیل در ایمنی ذاتی در سلول‌های ماکروفاژ انسانی در مواجهه با باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس

سابقه و هدف: یکی از اهداف سلولی اولیه مایکوباکتریوم‌ها، ماکروفاژها هستند که باکتری استراتژی‌های مختلفی برای زنده ماندن و تکثیر در داخل فاگوزوم‌ها از جمله مانند ممانعت از اسیدیفیکاسیون فاگوزوم و ممانعت از ادغام فاگوزومی دارند. از طرفی اهمیت polarization و plasticity ماکروفاژها در مواجهه با عوامل عفونی، بین ماکروفاژهای m1 و m2 کاملا شناخته شده است. باتوجه به نقش دو ژن dusp14 و rap2a در فرایندهای ایمنی ذاتی، هدف از این مطالعه بررسی بیان این ژن‌ها در ماکروفاژهای افراد سالم آلوده شده با سویه‌های pb8، h37rv و mtbrils است تا بتوان درک جامع‌تری از چگونگی عملکرد ایمنی ذاتی به‌دست آید.مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی، پنج فرد سالم که نتیجه تست ppd آن‌ها منفی بوده است و سابقه ابتلا به بیماری سل را نداشتند انتخاب شدند. سپس pbmc ها با استفاده از گرادیانت فایکول جدا شده و با دستگاه cell counter تعداد سلول‌های موجود در رسوب شمارش گردید در ساخت محیط کشت به ازای 500 میلی‌لیتر محیط stem span، 2 میلی‌لیتر لیپید کلسترول و 5 میلی‌لیتر (10x) pen/strep به محیط اضافه شد و پس از 9 روز در محیط کشت غنی شده، تمایز و در نهایت بیان ژن‌های dusp14 و rap2a پس از مواجهه با سه سویه pb8، h37rv و mtbrils طی 4، 18 و 48 ساعت پس از آلوده کردن سلول‌ها در محیط کشت، با روش ریل تایم بررسی گردید. بدین‌صورت که در ابتدا mrna از محیط استخراج شد و از روی آن cdna ساخته شد و pcr با مسترمیکس takara صورت پذیرفت. جهت اندازه‌گیری میزان نسبی بیان تک تک ژن‌ها از روش -δδ ct2 استفاده شد. به‌همین منظور میزان بیان هر ژن در مقایسه با ژن رفرنس برای هر بیمار در سه مرحله بررسی شد. جهت بررسی آماری از نرم‌افزار spss نسخه 22 و graphpad prism نسخه 8 استفاده شد.یافته‌ها: نتایج نشان داد که 4 ساعت پس از تیمار سلول‌ها با سویه h37rv بیان ژن rap2a نسبت به دو سویه دیگر بیان بیش‌تری داشته است، اگر چه افزایش بیان معنی‌دار نیست. هم‌چنین بیان ژن dusp14 در 4 ساعت پس از آلوده شدن با همه سویه‌ها اگرچه افزایش معنی‌داری پیدا نکرد؛ اما در سویه pb8 افزایش بیان بیش‌تری نسبت به سویه‌های دیگر داشت. در این مطالعه نشان داده شد که بیان ژن rap2a پس از گذشت 48 ساعت از آلودگی ماکروفاژها، سویه‌های h37rv و mtbrils نسبت به pb8 و گروه کنترل کاهش نشان داد. بیان ژن dusp14 نیز در همه زمان‌ها در گروه h37rv و mtbrils نسبت به pb8 و گروه کنترل کاهش معنی‌داری دیده شد.استنتاج: کاهش بیان ژن rap2a در دو سویه مایکوباکتریوم h37rv و mtbrils نشان می‌دهد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با کاهش فعالیت gtpase، سعی در اختلال در روند فاگوزوم و شیفت پاسخ‌ها به سمت ماکروفاژهای m2 دارد. مطالعات آتی بر روی نقش پلی‌مورفیسم‌های ژن‌های rap2a و dusp14 توصیه می‌گردد. 

the expression of innate immunity responsible genes in human macrophages encountering mycobacterium tuberculosis

background and purpose: macrophages are the primary cells that encounter this pathogen, and mycobacterium tuberculosis (mt) has developed several strategies to survive within the macrophage cytoplasm. one of the primary cellular targets of mycobacterium species are macrophages. these bacteria employ various strategies to survive and proliferate within phagosomes, including inhibiting phagosome acidification and preventing phagosome-lysosome fusion. on the other hand, the significance of macrophage polarization and plasticity in response to infectious agents is well-established, particularly in distinguishing between m1 and m2 macrophages. the dusp14 gene regulates the mitogen-activated protein kinase (mapk) pathway, while rap2a is a member of the gtpase family. considering the roles of the dusp14 and rap2a genes in innate immunity, the aim of this study is to investigate the expression of these genes in macrophages from healthy individuals infected with pb8, h37rv, and mtbrils strains. this analysis seeks to provide a more comprehensive understanding of the mechanisms underlying innate immune function.materials and methods: peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) were isolated from 40 cc of peripheral blood drawn from five healthy individuals with negative ppd test results, using ficoll density gradient centrifugation. the extracted cells were counted using a cell counter and cultured in stemspan medium supplemented with 2 ml of lipid cholesterol and 5 ml of pen/strep (10x) per 500 ml of culture medium. after nine days, the cells were infected with two mt strains: h37rv, mtbrils, and pb8. total rna was extracted from the infected cells 8, 18, and 48 hours post-infection. cdna synthesis was performed, and real-time pcr was conducted using takara master mix to analyze rap2a and dusp14 gene expression. the relative fold changes in gene expression were calculated using the 2–∆∆ct method, with statistical analyses performed using graphpad prism version 8 and spss version 20.results: the results showed that 4 hours after infection with the h37rv strain, the expression of the rap2a gene was higher than in groups infected with the other two strains, although the differences were not statistically significant. additionally, while dusp14 expression was not significantly increased 4 hours after infection with any of the three strains, its expression was higher in cultures infected with the pb8 strain. after 48 hours of mt infection, rap2a gene expression decreased in macrophages infected with the h37rv and mtbrils strains compared to the control and pb8-infected cells. similarly, dusp14 gene expression was significantly decreased in cells infected with the h37rv and mtbrils strains compared to pb8-infected cells and controls.conclusion: the observed decrease in rap2a gene expression in macrophages infected with the h37rv and mtbrils strains is associated with reduced gtpase activity, suggesting that these strains may disrupt phagosome function, potentially shifting responses towards m2 macrophage polarization. further studies investigating the role of rap2a and dusp14 gene polymorphisms in mt survival are recommended.