طراحی و ساخت حامل لنتی ویروسی بیان کننده mirna-499a و انتقال آن‌ به سلول ‌های بنیادی مزانشیمی انسان

سابقه و هدف: وکتورهای لنتی‌‌ویروسی حامل‌های مناسبی برای انتقال ژن به سلول‌ها بوده و می‌توانند سبب بیان بالا و مداوم ژن‌‌ها در سلول‌های میزبان شوند. ریز rna ها (mirnas )، گروهی از rna های غیر کد‌کننده کوچک هستند که بیان ژن را پس از رونویسی از طریق مهار ترجمه یا القاء تجزیه mrna کنترل می‌کنند و از این طریق فرآیند‌‌های زیستی متعددی از جمله تمایز سلولی را تنظیم می‌‌نمایند. مطالعاتی نشان داده‌اند که mirna499a در تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های قلبی نقش دارد. با توجه به مطالب ذکر شده، در این مطالعه ساخت وکتور لنتی‌‌ویروسی ناقل mirna499a جهت استفاده در تمایز سلول‌‌های قلبی مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش‌ها: رشته‌‌های p3 و p5 مربوط به mirna499a طراحی و ساخته شده و در پلاسمید ویژه‌‌ای کلون شدند. برای اطمینان از ورود صحیح این رشته‌های نوکلئوتیدی، هضم آنزیمی و توالی‌‌یابی انجام گردید. سپس ذرات لنتی‌ویروسی حامل رشته‌‌های mirna499a3p و p5mirna499a ساخته شدند و برای ترانس‌‌داکشن سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان انسان مورد استفاده قرار گرفتند.یافته‌ها: نتایج حاصل از هضم آنزیمی و توالی‌‌یابی، کلون شدن صحیح رشته‌‌های p3 و p5 مربوط به mirna499a به داخل پلاسمید را نشان دادند. بیان بالای egfp نشان دهنده کارایی بالای ترانس‌‌فکشن و ترانس‌داکشن بود. ویروس‌‌های حامل رشته‌‌های mirna499a3p/5p ساخته شده، توانستند سبب ترانس‌داکشن سلول‌‌های بنیادی مزانشیمی گردند.استنتاج: در این مطالعه حامل‌‌های لنتی‌ویروسی ناقل mirna499a3p/5p تولید شدند، که با توجه به میزان مناسب ترانس‌‌داکشن سلول‌‌های بنیادی مزانشیمی، می‌توانند در تمایز این سلول‌‌ها به سلول‌‌های قلبی مورد استفاده قرار گیرند.

Designing and Constructing the Lentiviral Vector Coding miRNA-499a and Transduction of Human Mesenchymal Stem Cells

Background and purpose: Lentiviral vectors (LVs) are suitable candidates for gene delivery to cells with stable and highlevel of transgene expression in target cells. MicroRNAs (miRNAs, miRs) are nonprotein coding, short (~22 nucleotides) and singlestranded RNAs that act as posttranscriptional regulators of gene expression, and are involved in various cellular processes, including proliferation, differentiation and apoptosis. Several studies have shown that miR499a promotes cardiac differentiation in cardiac stem cells. So, the aim of our study was to construct lentiviruses carrying miRNA499a.Materials and methods: Specific sequences of miRNA499a (3p and 5p) were designed and constructed. Then, miRNA499a was cloned into lentiviral vector. Analytical digestion and nucleotide sequence analysis were performed to ensure successful introduction of the miRNA to the vector. Then, the lentiviral particles produced (miRNA499a3p and miRNA499a5p) were used for transduction of human bone marrowderived mesenchymal stem cells (hBMMSCs).Results: Analytical digestion and sequence analysis confirmed the accuracy of the constructs. The high expression of eGFP represented the high efficiency of transfection and transduction. The lentiviral particles carrying miRNA499a3p/5p were made and could transduce hBMMSCs.Conclusion: In this study we made lentiviral particles carrying miR499a that could be used for differentiation of stem cells to cardiomyocytes.