ساخت پلاسمید نوترکیب بیان کننده ژن aid تحت کنترل پروموتر حساس به حرارت باکتریوفاژ لامبدا

سابقه و هدف: آنزیم activationinduced cytidine deaminase (aid) یک آنزیم اختصاصی لنفوسیت هایb در هایپرموتاسیون سوماتیک و نوترکیبی تعویض کلاس ژن های آنتی بادی در فولیکول های لنفوسیت b ارگان های لنفاوی محیطی می باشد. بیان نا به جای این آنزیم منجر به موتاسیون در سلول های غیر از لنفوسیت های b و حتی در باکتری escherichia coli شده است. با این وجود، القای موتاسیون در باکتری escherichia coli توسط بیان آنزیم aid، نیازمند بهینه سازی شرایط مطلوب و کنترل شده می باشد. بنابراین هدف این مطالعه تولید یک پلاسمید بیانی aid تحت کنترل پروموتر حساس به حرارت از باکتریوفاژ لامبدا می باشد. مواد و روش ها: در مرحله اول، جداسازی ژن aid از پلاسمید نوترکیب pgemt حاوی aid انجام شد. ژن تخلیص شده در پلاسمید ptg19t در باکتری e.coli سوش top10 کلون شد و سپس در یک پلاسمید بیانی القایی با دما حاوی پروموتر چپ باکتریوفاژ لامبدا و رپرسور حساس به حرارت ci857 منتقل و در باکتری e.coli قرار داده شد. در مرحله آخر، ژن مقاومت به تتراسایکلین جایگزین ژن مقاومت این پلاسمید نوترکیب شد. یافته ها: ژن aid در پلاسمید حاوی رپرسور حساس به حرارت ci857 از باکتریوفاژ لامبدا انتقال یافت. صحت توالی و چارچوب خوانش توسط الکتروفورز محصولpcr، استفاده از روش های هضم آنزیمی وهمچنین تعیین توالی ژنaid، تایید شد. استنتاج: ژن aid به طور موفقیت آمیزی در پلاسمید حاوی پروموتر حساس به حرارت از باکتریوفاژ لامبدا کلون شد. این پلاسمید نوترکیب می تواند در سویه های مختلف باکتریe.coli جهت تولید سویه های mutator استفاده شود.

Construction of the Recombinant Plasmid Expressing AID under the Control of Temperature-sensitive Promoter of Bacteriophage Lambda

Background and purpose: Activationinduced cytidine deaminase (AID) is a Bcell specific enzyme responsible for somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) of antibody genes within the Bcell follicle of peripheral lymphoid organs. Ectopic overexpression of the enzyme leads to mutations in nonB cells and Escherichia coli (E.coli) genes. However, induction of mutations in E.coli by expression of AID requires highly regulated conditions. Therefore, the aim of this study was to construct a plasmid expressing AID under the control of tightly regulated temperaturesensitive promoter of bacteriophage lambda..Materials and methods: The AID gene was isolated from PGEMT recombinant plasmid, containing AID and cloned into PTG19T vector. Then, AID was ligated to an expression plasmid under the control of left promoter of bacteriophage lambda and mutant thermolabile cI857 repressor. Finally, the resistance marker of the engineered plasmid was replaced by tetracycline resistance gene.Results: The whole open reading frame of AID was ligated into a plasmid containing a cI857sensitive receptor lambda bacteriophage. The sequence and reading frame accuracy of the cloning was confirmed by electrophoresis of PCR products on agarose gel, restriction enzyme digestion, and nucleotide sequencing methods.Conclusion: In current study, the AID was successfully cloned into an expression plasmid containing thermosensitive promoter of bacteriophage lambda. The recombinant plasmid could be used in different strains of E.coli to produce mutator strains.