کلون کردن، تعیین توالی و مطالعه خصوصیات ژن و cDNAبتا 1 و 4 اندوگلوکوناز IقارچTrichoderma reesei

اندوگلوکاناز از آنزیمهای سلولازی می باشد که پیوندهای بتاگلوکوزیدی را بطور اتفاقی در ملکولهای سلولز قطع نموده و تولید قطعات کوتاه الیگوساکاریدی می کند. در این تحقیق، تعداد 6 جدایه قارچ تریکودرما از نظر تولید آنزیمهای سلولازی در محیط مندلز مورد بررسی قرار گرفته و جدایه trichoderma reesei ptcc5142 با تولید u/ml37/0 بعنوان فعالترین جدایه از نظر تولید آنزیم بتا 1 و 4 اندوگلوکاناز انتخاب گردید. همچنین جهت شناسایی ژن کد کننده آنزیم بتا 1 و 4 اندوگلوکاناز (egll)i از جدایه انتخابی، استخراج dna ژنومی بروش ctab صورت گرفت. برای تکثیر این ژن از دو پرایمر اختصاصی (ebi, efi) استفاده گردید و قطعه مورد انتظار بطول bp 1524 بدست آمد. الگوی هضم آنزیمی (restriction pattern) توسط دو آنزیم pstl, ecorv قطعه مذکور را تایید کردو پس کلون در وکتور pbluscript sk(+) جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفت. همچنین توسط cdna, rt-pcr ژن مذکور تهیه ( bp 1380) و بعد از تایید و کلون کردن در وکتور pbluscript sk(+) تعیین توالی گردید. مقایسه توالی dna ژنومی و cdna مربوطه نشان داد که توالی کد کننده این ژن پروتئینی بطول 459 اسید آمینه را کد می نماید. توالی dna بدست آمده از این ژن با توالی ثبت شده ژن بتا 1 و 4 اندوگلوکاناز i در gene bank مربوط به قارچ t. reesi vtt-d 80133، سه نوکلئوتید اختلاف داشت در صورتیکه در سطح پروتئین اختلاف به دو اسید آمینه در ناحیه کاتالیتیکی این آنزیم محدودمی گردد. مقایسه ساختمان سوم ناحیه کاتالیتیکی این آنزیم با آنزیم egll قارچ t. reesi vtt-d 80133 نشان می دهد که موقعیت نسبی اتمهای backone (1480) بین دو ساختار مذکور با rmsd برابر a47/0 بر اساس 370 کربن آلفا معادل در دو ساختار با rmsd برابر a47/0 تطبیق می کند.