بررسی مقایسه‌ای شرایط طبیعی و واسرشته در محلول‌سازی و تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس

زمینه مطالعه: لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس عامل اصلی تعدیل سیستم ایمنی و تحریک لنفوسیت‌‌های t تنظیمی در میزبان می‌باشد و باعث افزایش جمعیت سلول‌های(forkhead box p3) foxp3+ و کاهش التهاب می‌شود و می‌تواند به عنوان کاندیدای دارویی در درمان بیماری‌‌های خودایمن معرفی شود.هدف: مقایسه تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در دو شرایط واسرشته و طبیعی به منظور افزایش بازیابی و حفظ فعالیت زیستی آن می‌باشد. روش‎کار: یک توالی به طول 660 جفت‌باز از لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در پلاسمید pet32-a سنتز و در باکتری اشریشیا کلی bl21(de3) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 6 ساعت با ایزوپروپیل بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (iptg) 1 میلی‌مولار القا و بیان شد. در مطالعه حاضر بافر لیز‌کننده اوره 8 مولار (ph=8) و بافر حاوی ایمیدازول 01/0 مولار همراه با لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر برای شکستن سلول‌های باکتریایی و محلول‌سازی پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. بافرهای فوق همراه با سونیکه کردن، به منظور شکستن سلول‌های باکتری استفاده شد و لام‌های میکروسکوپی تهیه و با رنگ‌آمیزی گرم بررسی شدند. پروتئین نوترکیب استخراج شده تحت شرایط واسرشته و طبیعی با استفاده از رزین نیکل-نیتریلوتری‌استیک‌اسید آگاروز و رزین نیکل-نیتریلوتری‌استیک‌اسید سفاروز تخلیص شد. ارزیابی ایمونوژنیسیته پروتئین نوترکیب با روش دات‌بلات با سرم خرگوش چالش شده با پروتئین نوترکیب انجام شد.نتایج: بیشترین مقدار بیان پروتئین با وزن مولکولی 41 کیلودالتون در ساعت ششم پس از القا در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با iptg 1 میلی‌مولار حاصل شد. بافر اوره 8 مولار (ph=8) حاوی لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر همراه با سونیکه کردن، مقدار زیادی از پروتئین نوترکیب استخراج شد. تخلیص پروتئین تحت شرایط واسرشته با استفاده از رزین نیکل- آگاروز مقدار پروتئین بیشتری نسبت به رزین نیکل سفاروز بازیابی شد. نتایج آزمایش دات‌بلات نیز حضور آنتی‌بادی igg (immunoglobulin g) اختصاصی علیه پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در سرم خرگوش ایمن شده تا رقت 1:500 را مورد تایید قرار داد.نتیجه گیری نهایی: استفاده از روش واسرشته بر فعالیت زیستی پروتئین تاثیر منفی نداشت و با این روش مقدار بیشتری پروتئین در سیستم باکتریایی بازیابی گردید. پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس تخلیص شده با این روش می‌تواند با اهداف مختلف مورد استفاده قرار گیرد.

a comparison survey on native and denaturation conditions for solubilization and purification of toxocara canis c-type lectin recombinant protein

background: toxocara canis c-type lectin (t. canis-ctl) is the main protein part of the secretory-excretory product secreted by toxocara canis infective larvae. t. canis-ctl can stimulate immune response-mediated regulatory t lymphocytes, increase the foxp3+ cells population, and reduce severe inflammatory responses. t. canis-ctl is a promising candidate for immune modulation in some autoimmune diseases, deserving further investigation.objectives: the current research aimed to purify the recombinant t. canis-ctl under denaturation and native condition to increase exploration and maintain biological activity.methods: the expression vector, pet32a was constructed with the partial sequence 660bp of t. canis-ctl and expressed in e. coli bl21 (de3). t. canis-ctl protein expression was induced by iptg (1 mm) at 37°c after 6 h. in this study, different buffers were used for cell explosion and recombinant protein solubilization, including lysis buffer with urea (8 m, ph=8) and lysozyme enzyme as well as lysis buffer with imidazole (0.01 m) and lysozyme enzyme, and previous buffers in addition to sonication. the effect of these buffers was evaluated in bacterial cells explosion, using gram-staining and microscopic examination. recombinant t. canis-ctl protein was extracted and purified under denaturation and native condition using ni-nta affinity chromatography by agarose and sepharose resin. a new zealand male rabbit was immunized with the recombinant protein to evaluate the bioactivity of the protein. results: lysis buffer with urea (8 m, ph=8) and lysozyme enzyme, in addition to sonication, provided acceptable results, and an additional amount of recombinant t. canis-ctl protein was secreted in the buffer. protein purification under denaturation conditions with ni-nta agarose affinity chromatography also provides further recombinant protein. most of the induction of recombinant t. canis-ctl with 41 kda molecular weight was collected 6 h after induction at 37°c. dot-blot results illustrate the brown dot, which showed a 1:500 titer of specific igg polyclonal antibody has developed in the sera of rabbits immunized with t. canis-ctl recombinant protein.conclusions: the denaturation condition did not affect the biological activity of the t. canis-ctl recombinant protein and can recover a further amount of recombinant proteins.