ارزیابی تکنیک pcr-rflp در شناسایی تنوع ژنتیکی کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپa

زمینۀ مطالعه: کلستریدیوم پرفرنجنس باسیل گرم مثبت بی‌هوازی و دارای اسپور است که بیوتایپ a آن مسئول انواع بیماری‌ها از جمله التهاب روده، اسهال خونی و قانقاریای گازی و یکی از عوامل اصلی سندرم خونریزی دهنده روده گاوها می‌باشد. تنوع ژنتیکی می‌تواند بیشترین تنوع فنوتیپی، توزیع جغرافیایی، ویژگی میزبانی، بیماریزایی، مقاومت آنتی بیوتیکی و حدت را در باکتری‌ها توضیح دهد. روش مولکولی مبتنی بر الگوی باندهایdna ، باکتری را بر اساس اندازه قطعات تولید شده توسط هضم آنزیمی ژنوم طبقه بندی می‌کند.هدف: استاندارد سازی و کاربرد تکنیک pcr-rflp در شناسایی تنوع ژنتیکی جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ a.روش‎کار: استخراج dna ژنومی سویه‌ها و سنتز توالی کامل لوکوس ژنی توکسین آلفا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده با تکنیک pcr انجام شد. برش آنزیمی آمپلیکون‌های سنتز شده با آنزیم محدودالاثر mse1 انجام و قطعات حاصل با تکنیک الکتروفورز از یکدیگر تفکیک شدند و توسط نرم افزار‌های imagej وntsyspc  مورد بررسی قرار گرفتند.نتایج: یافته‌های به دست آمده نشان داد که توالی لوکوس ژنی توکسین آلفا ممکن است تغییرکند و حفاظت شده نباشد. در مطالعه حاضر چهار الگوی مختلف بر مبنای برش آنزیمی شناسایی شد. جهش در این لوکوس می‌تواند منجر به ایجاد تنوع در کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ a و ایجاد سویه‌های جدید شود.نتیجه­گیری نهایی: لوکوس ژنی توکسین آلفا می‌تواند یک نشانگر مولکولیdna  در کلستریدیوم پرفرنجنس محسوب شود و تکنیک pcr-rflp به عنوان ابزاری برای تایپینگ این باکتری و تخمین میزان روابط فیلوژنتیکی از طریق مطالعات مقایسه‌ای توالی‌های نوکلئوتیدی کاربرد داشته باشد.

evaluating pcr-rflp technique in identifying genetic diversity clostridium perfringens biotype a

background: clostridium perfringens (c. perfringens) is an anaerobic gram-positive bacillus with spores, whose biotype a is responsible for a variety of diseases, including intestinal inflammation, bloody diarrhea, and gas gangrene, and hemorrhagic bowel syndrome. genetic variety can explain the bacteria’s phenotypic diversity, geographic distribution, host specificity, pathogenicity, antibiotic resistance, and virulence. a molecular method using the pattern of dna bands classifies bacteria based on the size of fragments produced by enzymatic digestion of the genome.objectives: this study aims to standardize the polymerase chain reaction (pcr)- restriction fragment length polymorphism (rflp) method in identifying the genetic diversity of c. perfringens biotype a isolates.methods: the genomic dna of the investigated strains was extracted, and the complete sequence of the alpha toxin gene locus was synthesized using specific primers designed by pcr technique. enzymatic cleavage of the synthesized amplicons was performed with the mse l restriction enzyme, and the resulting fragments were separated by electrophoresis and analyzed by imagej and ntsyspc software.results: the findings showed that the alpha toxin gene locus sequence may change and is not conserved. in this research, 4 different patterns were identified based on enzymatic cleavage. mutations in this locus can lead to diversity in c. perfringens biotype a and the creation of new strains.conclusions: the results of this research showed that the alpha toxin gene locus could be considered a dna molecular marker in c. perfringens, and the pcr-rflp technique can be used as a tool for typing this bacterium and estimating the phylogenetic relationships through comparative studies of nucleotide sequences.