ارزیابی اثر مایع رویی ‌کشت سودوموناس آئروژینوزا بر رفع اثر مهارکنندگی هپارین در آزمون real-timepcr

زمینۀ مطالعه: هپارین یک گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته است. خون یک منبع متداول برای ردیابی dna موجود در انواع نمونه‌ها می‌باشد که برای جلوگیری از انعقاد آن از ضد انعقادهایی چون هپارین و  edtaاستفاده می‌شود. هپارین به علت داشتن اثر مهارکنندگی شدید برروی pcr در نمونه‌هایی که قرار است مورد ردیابی dna قرار بگیرند، بکار نمی‌رود. جهت حذف اثر مهاری هپارین بر آزمون pcr، روش‌های فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی وجود دارد. هدف: مطالعه حاضر ابتدا با هدف مقایسه شدت اثر مهارکنندگی دو ضد انعقاد هپارین وedta  بر real-timepcr(qpcr)، سپس بررسی اثر آنزیم هپاریناز موجود در عصاره محیط‌کشت باکتری سودوموناس‌ آئروژینوزا بر رفع اثر مهار‌کنندگی هپارین طی‌ real-timepcr صورت گرفت.روش‎کار: در مطالعه حاضر ابتدا دو نمونه خون هپارینه و edtaدار جهت بررسی شدت اثر مهارکنندگی مورد آزمون real-timepcr قرار گرفتند. سپس در ادامه به نمونه خون هپارینه آلوده به باکتری اشیرشیاکلی در‌ دو گروه با شرایط مختلف، عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آئروژینوزا اضافه شد. در گروه اول ابتدا dna موجود در نمونه خون هپارینه، توسط روش فنول-کلروفرم ایزوآمیل ‌الکل استخراج شد. سپس‎ گرمخانه‌گذاری این نمونه‌ها با عصاره محیط‌کشت باکتری سودوموناس ‌آئروژینوزا در ساعات مختلف صورت گرفت، اما درگروه دوم، نمونه‌ها قبل‌ از استخراج dna، در ساعات مختلف گرمخانه‌گذاری شدند. همچنین غلظت dna موجود در هر دو گروه توسط دستگاه نانودرآپ انداز‌ه‌گیری شد و در نهایت تمام نمونه‌ها مورد آزمون real-timepcr قرارگرفتند.نتایج: تجزیه ‌و تحلیل نتایج حاصل از نمونه‌های مورد پژوهش نشان داد که نمونه خون هپارینه با وجود این‌که غلظت dna بیشتری را نسبت به نمونه خون edtaدار شامل می‌شود، اما به‌طور کامل مانع تکثیر ژنوم ‌می‌شود. همچنین تیمار خون هپارینه به همراه عصاره محیط‌کشت باکتری سودوموناس ‌آئروژینوزا قبل از استخراج dna به مدت زمان بیشتر از 24 ساعت، موجب رفع اثر مهاری هپارین طی‌ آزمون real-timepcr، حتی در چرخه آستانه (ct:cycle thershold) پایین‌تر از نمونه edtaدار می‌شود.نتیجه­گیری نهایی: استفاده از عصاره محیط‌کشت باکتری سودوموناس آئروژینوزا ممکن است محققین را قادر سازد، بتوانند بدون نیاز به استفاده از آنزیم هپاریناز تجاری گران‌بها و محدود، از نمونه خون هپارینه در راستای تقویت و تشخیص ژنوم استفاده کنند.

evaluating the effect of culture supernatant of pseudomonas aeruginosa on removing the inhibitory effect of heparin in real-time pcr test

background: heparin is a sulfated glycosaminoglycan. blood is a common source for dna detection in all kinds of samples, and anticoagulants such as heparin and ethylenediaminetetraacetic acid (edta) are used to prevent coagulation. because heparin has a strong inhibitory effect on polymerase chain reaction (pcr), it is not used in samples that will be tracked by dna. there are physical, chemical, and enzymatic methods to eliminate the inhibitory effect of heparin on pcr test.objectives: first, to compare the intensity of the inhibitory effect of two anticoagulants, heparin, and edta, on the real-time pcr (qpcr), and then to investigate the impact of the heparinase enzyme present in the medium culture extract of pseudomonas aeruginosa, on removing the inhibitory effect of heparin during the real-time pcr.methods: in the present study, two blood samples containing heparin and edta were subjected to a real-time pcr test to check the intensity of the inhibitory effect. then, the medium culture extract of pseudomonas aeruginosa was added to the heparinized blood sample infected with escherichia coli bacteria in two groups with different conditions. in the first group, the dna in the heparinized blood sample was extracted by the phenol-chloroform isoamyl alcohol method. then, these samples were incubated with the extract of pseudomonas aeruginosa bacteria culture medium at different hours, but in the second group, the samples were incubated at different hours before dna extraction. also, the dna concentration in both groups was measured by a nanodrop device, and finally, all samples were subjected to a real-time pcr test.results: the results of the research samples showed that although the heparinized blood sample contains more dna concentration than the edta blood sample, it completely prevents genome replication. also, incubating heparinized blood with pseudomonas aeruginosa culture medium extract before dna extraction for more than 24 hours removes the inhibitory effect of heparin during the real-time pcr, even at a lower cycle threshold than the edta-containing sample.conclusions: the pseudomonas aeruginosa culture medium extract may enable researchers to use heparinized blood samples for genome amplification and diagnosis without using expensive and limited commercial heparinase enzyme.