بهینه‌سازی بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی انگل توکسوکارا کنیس در باکتری اشریشیا کلای سویه bl21(de3)

زمینۀ مطالعه: توکسوکاریازیس یک بیماری مهم زئونوز است که توسط نوزاد مرحله دوم توکسوکارا کنیس و توکسوکارا کتی ایجاد می‌شود. در خیلی از کشورهای معتدل توکسوکاریازیس رایج‌ترین عفونت کرمی است و سبب بروز عوارض شدید می‌شود. لکتین نوع سی از محصولات تولیدی در مرحله نوزادی این انگل است. این پروتئین در واکنش‌های ایمنی ازجمله ارسال سیگنال سلول‌های ایمنی در مهره‌داران، فعال کردن ایمنی ذاتی در مهره‌داران و بی‌مهرگان و القا هموستاز دخالت دارد.هدف: مطالعه حاضر با هدف بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی انگل توکسوکارا کنیس و بررسی خواص آنتی‌ژنی (پادگنی) آن صورت گرفته است.روش‎کار: توالی نوکلئوتیدی مرجع مربوط به لکتین نوع سی(ctl) انگل توکسوکارا کنیس از بانک ژن استخراج شد. سپس پلاسمید pet32a حاوی توالی مورد نظر توسط شرکت generay سنتز گردید. پلاسمید نوترکیب به باکتری اشریشیا کلای سویه bl21(de3) منتقل شد. بیان این پروتئین با استفاده از روش‌های sds-page و دات بلات بررسی و با سرم انسانی مثبت، مورد تایید قرار گرفت.نتایج: مطالعه حاضر نشان داد که بهینه‌سازی شرایط برای دستیابی به بیشترین میزان تولید پروتئین با انتخاب باکتری اشریشیا کلای سویه bl21(de3)، دمای 37 درجه سانتی‌گراد پس از القا و غلظت 1 میلی‌مولارiptg  حاصل گردید. پس از بهینه‌سازی پروتئین نوترکیب با غلظت 0.6±1160میکروگرم بر میلی‌لیتر استخراج شد. وزن مولکولی پروتئین حاصل 42 کیلودالتون بود. پاساژ پلاسمید نوترکیب قبل از القا، در باکتری اشریشیا کلای سویه dh5α باعث افزایش معنی‌دار بیان پروتئین گردید. نتایج ارزیابی بهینه‌سازی شرایط، با روش‌های sds-page و دات‌بلات نشان داد که بیشترین میزان تولید پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی انگل توکسوکارا کنیس در شرایط بهینه‌سازی حاصل شده است.نتیجه گیری نهایی: جهت تولید هر پروتئین نوترکیب به‌ویژه در مقادیر زیاد و به‌منظور مصارف تجاری لازم است که بهینه‌سازی مخصوص آن پروتئین، انجام شود و دقیقاً براساس شرایط بهینه‌سازی تعیین‌شده، تولید پروتئین نوترکیب قابل انجام است. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که شرایط بهینه جهت تولید پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی، انتخاب باکتری اشریشیا کلای سویه bl21(de3)، دمای 37 درجه سانتی‌گراد و مدت زمان 4 ساعت پس از القا است که با حفظ ویژگی‌های ایمنی‌زایی نیز همراه است. به‌طورکلی می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که سویه باکتری انتخاب شده و همچنین دما و زمان القا بر میزان بیان و تولید پروتئین‌های نوترکیب مانند لکتین نوع سی انگل توکسوکارا کنیس تاثیر مستقیم دارد.

Optimization of Expression and Extraction of Toxocara canis Recombinant C-Type Lectin Protein in Escherichia coli BL21 (DE3)

BACKGROUND: Toxocaiasis is an important zoonotic disease caused by the second stage larvae of Toxocara canis and Toxocara cati. Toxocariasis is the most common worm infection in several temperate countries and causes severe complications. Ctype lectin is one of the larval stage products of this parasite. It is involved in immune responses, including cellular signals in vertebrate immunity, activation of innate immunity in vertebrates and nonvertebrates, and induction of homeostasis.  OBJECTIVES: The current research aimed to optimize the production of recombinant Ctype lectin of Toxocara canis and investigate its antigenic properties. METHODS: Reference nucleotide sequence of lectin type C (CTL) of Toxocara canis (T. canis) was extracted from Genbank. Recombinant Plasmid, pET32a, including the desired sequence was then constructed by GENERAY. The recombinant plasmid was transformed to Escherichia coli strain BL21 (DE3). The expression of the recombinant protein was investigated using SDSPAGE and dot blot methods and approved with human T. canis positive serum. RESULTS: The findings of the present study showed that optimization and high level production of recombinant protein expression was achieved by selecting Escherichia coli (BL21 (DE3), 37 °C temperature for 4 hours after induction and 1 mM IPTG concentration. After optimization, the recombinant protein was obtained at a concentration of 1160±0.6 µg/mL. The molecular weight of the resulting recombinant protein was 42 kDa. Recombinant plasmid passage in Escherichia coli DH5α strain caused a significant increase in recombinant protein expression. The results of condition optimization evaluation, with SDSPAGE and Dot blot methods, showed that the highest production of recombinant C type lectin protein of T. canis was obtained under optimized conditions. CONCLUSIONS: Based on these results, to produce reasonable amounts of specific Ctype lectin recombinant protein, further studies are needed to evaluate its immunogenicity and protection against Toxocara canis infection.