کلون و بیان پروتئین حدت cfp-10 مایکوباکتریوم بویس سویه an5

زمینۀ مطالعه:سل گاوی به وسیله گونه مایکوباکتریوم بویس ایجاد می‌شود و اثرات مهمی در بهداشت عمومی و اقتصادی از جمله تجارت حیوانات و تولید دارد. برنامه کنترل مرسوم براساس آزمایش پوستی و کشتار گاوهای آلوده به سل است. علی‌رغم اعتماد به این آزمایش، واکنش‌های مثبت کاذب از معایب آن به شمار می‌رود که جهت رفع آن استفاده از پروتئین‌هایی با ویژگی بالاتر توصیه می‌گردد. هدف: مطالعه حاضر به منظور کلون، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب cfp-10 به عنوان آنتی‌ژن مایکوباکتریوم بویس صورت گرفت. روش‎کار: ژن پروتئین cfp-10 با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره پلی‌مراز تکثیر شد. محصول واکنش پس از هضم توسط دو آنزیم ecori و hindiii در وکتور pet23a(+) کلون شد و بعد از ترانسفورماسیون در سلول dh5α e. coli تکثیر گردید. پس از الحاق و تعیین توالی، وکتور کلون شده در سلول بیانی bl21 e. coli ترانسفورم شد. جهت القاء، از ایزپروپیل-دی-بتا-تیوگالاکتوپیرانوزید استفاده گردید. جهت انحلال اجسام توده‌ای در پلت سلولی از اوره 8 مولار استفاده شد. پس از تخلیص پروتئین نوترکیب با رزین نیکل، حذف اوره با گرادیان کاهنده انجام گرفت. نتایج: صحت کلون ژن cfp-10 با تعیین توالی اثبات گردید. بیان پروتئین cfp-10 با استفاده از مونوکلونال آنتی‌بادی اختصاصی با وسترن بلاتینگ اثبات شد. نتایج تعیین توالی ژن در کنار وسترن بلاتینگ، حاکی از آن بود که پروتئین نوترکیب بدست آمده در وزن مولکولی حدود 10 کیلو دالتون به خوبی بیان و تخلیص گردیده است. نتیجه گیری نهایی: نتایج نشان داد که ژنcfp10  به خوبی در سیستم پروکاریوتی کلون، بیان گردید و پروتئین cfp-10 می‌تواند جهت مطالعات بیشتر در تولید کیت‌های تشخیصی علیه سل گاوی مورد استفاده قرار گیرد.

Cloning and Expression of Virulent Protein CFP10 from Mycobacterium bovis Strain AN5

BACKGROUND: Bovine tuberculosis caused by Mycobacterium bovis is an important disease that has negative effects on public health and entails economic loss. Traditional controlling programs for cattle  focus on test and slaughter strategy, and false positive is one of the disadvantages associated with tuberculin skin test. To overcome this limitation, proteins with high specificity have to be utilized. OBJECTIVES: The objective of this study was to clone and express virulent protein CFP10 from Mycobacterium bovis AN5. METHODS: Fulllength genes of cfp10 were amplified by PCR technique. In parallel, pET23a(+) and PCR products were double digested by EcoRI and HindIII. Ligation was performed at 16˚C followed by transformation into competence E. coli DH5α. After being identified with sequencing, the cloned vector was transformed into E. coli BL21. Induction was performed by isopropylβDthiogalactopyranoside (IPTG). Urea 8M was used to dissolve the expressed protein in the inclusion body form. Recombinant protein was purified by NickleResin, and urea was eliminated by decreasing the gradient. RESULTS: The CFP10 gene clone was proved by sequencing method. The CFP10, as a 10 KDa protein, was confirmed by Western blotting using monoclonal antibodies. Based on the results, the recombinant protein was successfully cloned and expressed. CONCLUSIONS: The results showed that cfp10 gene was successfully cloned and expressed in prokaryotic system, indicating that this recombinant protein could be utilized in diagnostic kits against bovine tuberculosis in the future.