جداسازی، شناسایی و تعیین هویت مولکولی گونه‌‌‌های کریپتوسپوریدیوم در اسهال گوساله‌‌‌ها به روش multiplex nestedpcr

زمینه مطالعه: تشخیص گونه­های کریپتوسپوریدیوم براساس خصوصیات مورفولوژی بسیار محدود بوده و به تنهایی فاقد ارزش تاکسونومیک است، و لذا استفاده از روش­های مولکولی این محدودیت­ها را تا حدودی برطرف می­سازد. هدف: هدف از این مطالعه تعیین ژنوتیپ­های غالب کریپتوسپوریدیوم در گوساله­های مبتلا به اسهال بود. روش کار: مطالعه در گوساله‌های کمتر از 3 ماه و برای مدت 2 سال انجام شد. در طول دوره مطالعه، 160 نمونه مدفوع از گوساله‌های جوان جمع‌آوری شده و ابتدا از طریق میکروسکوپی و سپس با استفاده از تکنیک‌های مولکولی مورد بررسی قرار گرفت. مدفوع از جهت حضور اواوسیست‌های کریپتوسپوریدیوم توسط روش شناورسازی با آب شکر شیتر و به دنبال آن روش رنگ‌آمیزی ذیل نلسون  مورد بررسی قرار گرفت. دی ان آ انگل استخراج و پروتکل multiplex nestedpcr براساس ژن 18srrna جهت شناسایی سه گونه سازگار در گاو (یعنی کریپتوسپوریدیوم اندرسونی،  کریپتوسپوریدیوم بوویس و کریپتوسپوریدیوم رایانه) به علاوه گونه مشترک بین انسان و دام یعنی کریپتوسپوریدیوم پارووم انجام شد. نتایج: 110 نمونه مدفوع از دامداری­های موجود در استان البرز و 50 نمونه مدفوع نیز از دامداری­های شهر شاهرود جمع­آوری گردید. از 160راس حیوان مورد آزمایش 90 راس ماده و 70 راس نر بودند. در مجموع در میان 160 راس دام مورد آزمایش 85 مورد (53.12 درصد) مبتلا به اسهال بودند که 55 مورد (34.37درصد) از این تعداد حیوان تحت آزمایش با استفاده از رنگ‌آمیزی ذیل‌ نلسون مثبت تشخیص داده شدند. از آنجایی‌که تمام موارد مثبت مربوط به نمونه­های اسهالی و مرتبط با گوساله­های زیر یک ماه بود، ارتباط معنی­داری مابین وضعیت اسهال و حضور این انگل مشاهده گردید (0.05p <). از نظر توزیع فصلی تفاوتی در میزان موارد اسهالی و موارد مثبت انگلی مشاهده نشد. حضور باند 305 جفت بازی در کلیه نمونه­های مثبت ذیل نلسون موید حضور گونه کریپتوسپوریدیوم پارووم در تمامی نمونه­ها بود. نتیجه‌گیری نهایی: گوساله­های شیرخوار بیشتر با کریپتوسپوریدیومپارووم آلوده می­شوند که تحقیق حاضر نیز موید این مطلب بود.

Isolation, Characterization and Molecular Identification of Cryptosporidium spp. Causing Diarrhea in Young Calves by Multiplex NestedPCR

BACKGROUND: Diagnosis of Cryptosporidium species based on morphological characteristics is very limited and has no taxonomic value alone, and therefore the use of molecular methods removes these limitations to some extent. OBJECTIVES: The aim of this study was to determine the predominant Cryptosporidium genotypes in calves with diarrhea. METHODS: Study were conducted in calves aged less than 3 months for a period of 2 years. During the study period, 160 dung samples were collected from neonatal calves and examined first microscopically and then by molecular techniques. Stools were analyzed for the presence of Cryptosporidium oocysts by Sheather’s Sugar Flotation Solution followed by ZielNeelsen staining method. DNA of parasite was extracted and multiplex nestedPCR protocol basis on the 18srRNA were done to identify three cattleadapted species (C. andersoni, C. bovis and C. ryanae) plus the zoonotic species C. parvum. RESULTS: 110 fecal samples were collected from livestock in Alborz province and 50 fecal samples were collected from livestock in Shahroud city. Of the 160 animals examined, 90 were female and 70 were male. In total, out of 160 animals examined, 85 cases (53.12%) had diarrhea, of which 55 cases (34.37%) were positive using ZielNeelsen staining. Since all positive cases were related to diarrhea samples and related to calves under one month old, a significant relationship was observed between diarrhea status and the presence of this parasite (p < /em><0.05). In terms of seasonal distribution, no difference was observed in the rate of diarrhea and positive parasitic cases. The presence of 305 bp band in all ZielNeelsen positive samples confirmed the presence of C. parvum in all samples. CONCLUSIONS: Neonatal calves are more likely to be infected with Cryptosporidium parvum, as confirmed by the present study.