کلونینگ و بهینه‌سازی بیان ژن آنزیم فورمات دهیدروژناز در اشرشیا‌کلی

مقدمه: افزایش گازهای گلخانه ای و گرم شدن زمین باعث توجه جهانی در اصلاح این پدیده گردیده است. آنزیم فورمات دهیدروژناز قادر به کاهش co2 در تبدیل آن به فورمات بوده که توسط آنزیم الکل دهیدروژناز به متانول تبدیل می‌شود. هم‌چنین این آنزیم در فرایند تولید دارو ساکساگلیپتین می تواند مورد استفاده قرار گیرد. هدف این تحقیق ارزیابی اثر غلظت‌های مختلف القا کننده (isopropyl ß-d-1-thiogalactopyranoside) ipgt، زمان القا و محیط کشت بر تولید آنزیم فورمات دهیدروژناز می‌باشد.روش بررسی: این مطالعه یک مطالعه آزمایشگاهی است. در ابتدا پرایمرهای اختصاصی به منظور تکثیر قطعه ژنی طراحی گردید. قطعه ژنی توط پرایمرهای اختصاصی و روش pcr تکثیر گردید. ژن آنزیم فورمات دهیدروژناز داخل  وکتور pet28b وارد و به داخل باکتریe.coli  انتقال یافت. به منظور بهینه‌سازی بیان پروتئین طراحی آزمایش با روش تاکوچی انجام و تاثیر دما، غلظت القاکننده و نوع محیط کشت بر میزان بیان پروتئین در دو سطح متفاوت، بررسی شد.نتایج: نتایج colony-pcr تکثیر ژن آنزیم فورمات دهیدروژناز در باکتری e.coli را تایید کرد. بررسی اثر زمان القا کننده و غلظت  iptg نشان داد زمان وغلظت القاگر اثر منفی بر تولید دارند. بیشترین میزان تولید پروتئین نوترکیب در 24 ساعت بعد از القا دمای 25 درجه سانتی‌گراد، غلظت 0/1 iptg و حضور سوربیتول می‌باشد. در بررسی اثر محیط کشت بر بیان پروتئین محیط کشت lb بهترین محیط بود. نتیجه‌گیری: افزایش غلظت iptg تاثیری در افزایش بیان آنزیم نداشت، در نتیجه می‌توان با غلظت‌های کم iptg پروتئین را تولید کرد که مقرون به صرفه می‌باشد هم‌چنین کاهش زمان موجب افزایش بیان پروتئین شود. محیط کشت (luriabroth) lb همراه سوربیتول مناسب‌ترین محیط القای بیان آنزیم فورمات دهیدروژناز است.

cloning and optimization of formate dehydrogenase gene expression in e. coli

introduction: the increase in greenhouse gas levels and the gradual warming of the earth have garnered worldwide interest. the enzyme formate-dehydrogenase can reduce co2 by converting it into formate, which is subsequently converted into methanol by the enzyme alcohol dehydrogenase. the purpose of this research was to evaluate the effect of different concentrations of ipgt, modifier, induction time and culture medium on the expression of formate-dehydrogenase enzyme and optimization.methods: specific primers were designed to amplify the gene fragment using polymerase chain reaction (pcr). the formate-dehydrogenase enzyme gene was inserted into the pet28b vector, and the recombinant plasmid was used to transform e.coli.  to enhance protein expression, a taguchi experimental design was conducted to investigate the effects of temperature, inducer concentration, and type of culture medium type on protein expression levels at two different levels.results: pcr results confirmed the amplification of formate-dehydrogenase enzyme gene in e. coli dh5α. induction time and concentration negatively impacted on expression. the highest level of expression of the recombinant protein was observed 24 hours post-induction at a temperature of 25°c, with an iptg concentration of 0.1 mm in the presence of sorbitol. lb culture medium was chosen as the best expression medium.conclusion: this study showed that low concentrations of iptg were sufficient for producing the recombinant protein, proving to be economical. reducing the induction time also increased protein expression. lb medium enhanced with sorbitol was identified to be the best culture medium for inducing the expression of the formate dehydrogenase enzyme.